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婴幼儿麻醉手术安全性的问题始终是社会关注的热点,在过去的若干年有大量的临床研究表明婴幼儿时期多次麻醉手术暴露对发育中的大脑有神经毒性,影响其远期学习记忆能力[1-3],然而单次暴露结论尚不一致[4]。Tau蛋白是认知功能领域研究的经典标志性蛋白,与神经损伤的发生密切相关[5-7]。Tau蛋白异常磷酸化后易从微管脱落,互相缠结形成不溶性聚合体,是形成神经元纤维缠结的重要因素[8-10]。而细胞外ATP对神经元兴奋性、可塑性有调控作用[11,12],本课题以细胞外ATP与Tau的相互作用为切入点,深入研究单次麻醉手术对幼年小鼠认知功能及神经损伤的影响,并探讨其分子机制,为相关脑保护提供理论支持。实验一:七氟烷麻醉加手术导致幼龄小鼠脑间质液中ATP水平增高目的:麻醉加手术可造成幼年小鼠远期认知功能障碍,机制尚不明确。本实验拟探讨七氟烷麻醉加手术对幼年小鼠(P8)远期认知功能的改变及脑组织ATP水平的影响。方法:选择出生8d(P8)的小鼠进行实验,将52只小鼠随机分为2组,对照组(Control)和七氟烷加手术组(Sevoflurane+Surgery)。其中七氟烷加手术组在3%七氟烷+60%O2条件下行剖腹探查手术,对照组只给予60%O2处理。待小鼠生长至第30天,进行Morris水迷宫测试,评价两组小鼠学习能力和记忆能力(Control组19只,Sevoflurane+Surgery组15只);七氟烷加手术处理后即刻,收集小鼠血液标本,取小鼠皮层组织(每组3只),应用ATP检测试剂盒检测小鼠脑皮质组织和血液中ATP水平;七氟烷加手术处理后即刻,提取两组小鼠线粒体,对小鼠线粒体呼吸功能进行检测(每组3只);给出生8d(P8)的小鼠置入微透析套管,分别于麻醉手术前、单纯麻醉状态下、和麻醉加腹部手术状态下收集脑间质液,测定脑间质液ATP含量(每组3只)。结果:1.七氟烷麻醉加手术可导致小鼠水迷宫逃避潜伏期延长,平台穿梭次数减少,致幼年小鼠远期学习记忆功能损伤;2.小鼠皮层组织ATP水平在七氟烷麻醉加手术组轻微升高;3.小鼠血液中ATP水平在两组间没有差异;4.两组小鼠皮层线粒体呼吸功能没有差异;5.同一只小鼠,单纯麻醉不影响脑间质液中ATP的水平,但是当给予手术刺激后,小鼠脑间质液中ATP水平明显升高,对照组小鼠脑间质液ATP水平稳定,不随时间升高。结论:七氟烷麻醉加手术可导致幼龄小鼠远期认知功能障碍,其机制可能与七氟烷麻醉加手术所致的脑间质液中ATP水平升高有关。实验二:细胞外ATP在七氟烷麻醉加手术引起的Tau蛋白磷酸化中的关键作用目的:上一部分实验发现麻醉加手术刺激可导致小鼠脑间质液ATP水平升高,本研究分别以小鼠、SH-SY5Y细胞系和原代培养神经元为研究对象,拟证明细胞外ATP升高可导致Tau蛋白磷酸化,是七氟烷麻醉加手术引起幼年小鼠远期学习记忆能力降低的重要原因。方法:1.选用出生8d(P8)的小鼠进行实验,共18只,随机分为3组,每组6只:对照组(Control)、ATP组(ATP)和七氟烷加手术组(Sevoflurane+Surgery)。麻醉手术后即刻处死小鼠,提取皮层组织,应用Western blot检测小鼠大脑皮层Tau-PS202/PT205、total Tau(Tau46)的表达;2.体外培养SH-SY5Y细胞,分为对照组(Control)、ATP组(ATP),ATP组培养基中加不同浓度的ATP刺激,应用Western blot检测细胞中Tau-PS202/PT205(AT8)、total Tau(Tau46)的表达;3.提取胎鼠神经元进行体外培养,分为对照组(Control)、ATP组(ATP),ATP组培养基中加不同浓度的ATP刺激,应用Western blot检测神经元细胞Tau-PS202/PT205(AT8)、total Tau(Tau46)的表达。结果:1.P8小鼠腹腔注射ATP和麻醉手术均能导致小鼠皮质Tau-PS202/PT205表达升高,而total Tau表达不受影响;2.在SH-SY5Y细胞中,培养基中ATP浓度高至2μM时,可导致Tau-PS202/PT205表达明显升高,total Tau表达不变;3.在原代培养神经元中,培养基中ATP浓度高至1mM时,可导致Tau-PS202/PT205表达明显升高,total Tau表达不变。结论:细胞外ATP升高无论在幼鼠、SH-SY5Y细胞系还是原代培养神经元中,均可引起Tau蛋白磷酸化,显著增加Tau-PS202/PT205表达水平,说明七氟烷麻醉加手术引起的脑间质液中ATP升高可导致Tau蛋白磷酸化,是引发幼龄小鼠麻醉手术后认知功能障碍的重要因素。实验三:CDK5是细胞外ATP导致Tau蛋白磷酸化的关键激酶目的:Tau蛋白磷酸化有多种激酶,APP、GSK3β、CDK5、MAPK1、MAPK3、JNK、PKA等等多种蛋白在不同条件下可导致Tau蛋白不同位点的磷酸化,可导致Tau-PS202/PT205磷酸化的激酶又有GSK3β、CDK5、PKA、CK1/2等许多种[13],为明确在七氟烷麻醉加手术模型中使Tau-PS202/PT205磷酸化的关键激酶,本实验通过蛋白质谱筛选差异蛋白加Western blot验证的方法寻找麻醉手术致Tau蛋白磷酸化的关键激酶。方法:1.出生8d(P8)小鼠各18只随机分为3组(n=6/组):对照组(Control)、ATP组(ATP)和七氟烷加手术组(Sevoflurane+Surgery)。麻醉手术后即刻处死小鼠,提取皮层组织,进行蛋白质谱分析,筛选可能的Tau蛋白激酶,应用Western blot验证小鼠大脑皮层GSK3β、p-GSK3β-ser9、p-GSK3β-tyr216、CDK5的表达;2.提取胎鼠神经元进行体外培养,分为对照组(Control)、ATP组(ATP),应用Western blot检测神经元细胞GSK3β、p-GSK3β-ser9、p-GSK3β-tyr216和CDK5的表达。结果:1.蛋白质谱分析筛选ATP组小鼠和Sevoflurane+Surgery组小鼠共同升高且大于2倍、与Tau磷酸化相关的激酶有GSK3β和CDK5;2.与Control组小鼠相比,ATP组和Sevoflurane+Surgery组小鼠皮层中总GSK3β均没发生改变,而p-GSK3β-ser9增高,p-GSK3β-tyr216降低,其活性受到了抑制。该结果表明ATP组和Sevoflurane+Surgery组Tau蛋白的磷酸化是非GSK3β依赖的。而CDK5表达水平则在ATP组和Sevoflurane+Surgery组均升高,差异具有统计学意义,说明CDK5才是七氟烷麻醉加手术模型中Tau蛋白磷酸化的关键激酶;3.在原代神经元中,与小鼠皮层结果不同,ATP组GSK3β量与磷酸化水平均与Control组没有差异,但CDK5水平同样是在ATP组升高,说明在原代神经元中CDK5才是细胞外ATP导致Tau蛋白磷酸化的关键激酶。结论:在麻醉加手术模型中,脑组织细胞外ATP升高,升高的细胞外ATP导致Tau蛋白磷酸化是通过CDK5激酶实现的,这一过程不依赖GSK3β。实验四:细胞外ATP作用于GluR2,激活CDK5从而导致Tau蛋白磷酸化目的:Tau蛋白和CDK5蛋白均是位于细胞内,细胞外ATP通过何种途径作用于细胞内的CDK5导致Tau蛋白磷酸化是该部分实验的研究目标。在质谱数据中筛选跨膜受体,发现GluR2表达显著增高,GluR2作为一个四次跨膜蛋白,极有可能是介导细胞外ATP与细胞内Tau蛋白磷酸化的关键受体。本实验拟通过使用GluR2特异性抑制剂pep2m抑制GluR2活性来验证在麻醉手术模型中,GluR2是否为介导细胞外ATP与细胞内Tau蛋白磷酸化的关键受体。另有49只小鼠分为四组,Control+aCSF组(N=12)、Sevoflurane+Surgery+aCSF组(N=12)及Control+pep2m组(N=10)、Sevoflurane+Surgery+pep2m组(N=13)于小鼠生后8d进行七氟烷麻醉加手术及药物干预,待小鼠长至30天进行行为学测试。方法:出生8d的小鼠36只,用随机数字表将其分为6组,每组6只:对照组+aCSF注射组(Control+aCSF)、ATP+aCSF组(ATP+aCSF)、七氟烷麻醉加手术+aCSF组(Sevoflurane+Surgery+aCSF)、对照组+pep2m组(Control+pep2m)、ATP+pep2m组(ATP+pep2m)、七氟烷麻醉加手术+pep2m组(Sevoflurane+Surgery+pep2m),应用Western blot检测神经元细胞CDK5和Tau-PS202/PT205的表达。结果:1.蛋白质谱分析数据显示ATP组小鼠和Sevoflurane+Surgery组小鼠GluR2表达均显著增高,这一结果在Western blot中得到了验证;2.与Control组小鼠相比,ATP组和Sevoflurane+Surgery组小鼠皮层中CDK5和Tau-PS202/PT205均增高,GluR2特异性抑制剂pep2m可抑制ATP腹腔注射和麻醉手术引起的CDK5和Tau-PS202/PT205表达增高;3.Pep2m可抑制麻醉手术引起的幼鼠远期空间学习记忆能力下降。结论:细胞外ATP通过与GluR2的相互作用引起CDK5表达增加和Tau蛋白磷酸化,进而引发学习记忆能力下降。小结1.单次七氟烷麻醉加手术可造成幼年小鼠远期认知功能障碍;2.七氟烷麻醉加手术可引起幼鼠脑间质液ATP水平增高,并且这一增高是中枢源性而非外周血来源的;3.细胞外ATP升高在动物和细胞水平均可导致Tau蛋白磷酸化增加;4.细胞外ATP升高导致的Tau蛋白磷酸化增加不依赖GSK3β,CDK5才是ATP升高导致的Tau蛋白磷酸化的关键激酶;5.细胞外ATP通过膜表面受体GluR2来调控CDK5表达和Tau蛋白磷酸化进而影响学习记忆能力。