论文部分内容阅读
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性产孢菌的模式菌株，纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)是枯草芽孢杆菌的一个亚种，其发酵生产的纳豆是一种具有较高营养价值和保健功能的食品，但由于Bacillus natto代谢过程中会产生大量的氨，严重影响了其风味，因此，研究枯草芽孢杆菌的产氨代谢途径具有非常重要的实际意义。在枯草芽孢杆菌的产氨代谢中，谷氨酸脱氢酶(Glutamatedehydrogenases，GDH)是连接碳代谢和氮代谢的一个关键酶。枯草芽孢杆菌中编码GDH的基因有两个：rocG基因和gudB基因。其中B. subtilis168菌株的rocG基因编码有活性的GDH，而gudB基因编码没有活性的GDH。敲除B. subtilis168菌株的rocG基因后，gudB基因会自发突变为gudB1基因，编码有活性的GDH(gudB1-GDH)。枯草芽孢杆菌GDH在代谢中的作用及调控机制已经取得了一些研究进展，但仅局限于rocG-GDH的分析，而缺乏对gudB1-GDH的研究。为了研究gudB1-GDH在代谢中的作用及调控机制，以B. subtilis168DNA为模板，经PCR扩增了829bp的rocG同源重组序列，并引入了Hind III和BamH I两个酶切位点。通过酶切酶连，将测序正确的rocG同源重组序列连至pMUTin4的Hind III和BamH I酶切位点间，成功构建了pMUTin4-rocG插入突变重组质粒，然后将其转化至B. subtilis168，通过PCR鉴定和测序验证后，成功获得了一株rocG失活突变株BS-△rocG，并对突变株和野生株的生长情况及GDH酶活做了初步比较，发现突变株生长情况和野生株相当，但突变株GDH酶活为4.641U/mg蛋白，高于野生株的3.042U/mg蛋白。因此得到的BS-△rocG中，gudB可能自发突变为gudB1，从而能够编码有活性的GDH，为研究枯草芽孢杆菌gudB1-GDH在代谢中的作用及调控机制奠定了基础。同时，为了改善纳豆风味，将B. subtilis168rocG插入失活突变株构建的方法运用到本课题组从商品纳豆中分离得到的Bacillusnatto(CGMCC No.2801)中，以Bacillus natto的DNA为模板，同样扩增了829bp的rocG同源重组序列，将其连至pMUTin4上，成功构建了Bacillus natto rocG插入失活载体pMUTin4-rocG1。通过化学转化的方法，将pMUTin4-rocG1转化Bacillus natto感受态细胞，但经过多次转化仍未能得到Bacillus natto rocG插入失活菌株，因此还需对转化方法进行进一步优化，以期获得低氨或无氨纳豆的发酵工程菌株。