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奶牛脂肪肝是奶牛围产期常发生的一种疾病,在该病过程中油酸是血液里产生最多的一种单不饱和游离脂肪酸。生物素是一种水溶性维生素,据研究表明油酸可以诱导多种细胞发生脂肪变性,而生物素具有缓解脂肪变性的作用,但两者的作用机制尚未明确。为了探究油酸致细胞脂肪变性的机制及生物素在其中的作用,本试验以大鼠肝细胞系BRL 3A为研究对象,探究油酸致BRL 3A脂肪变性过程中MAPK/TLR4/PPARy信号通路的作用及生物素的保护效应,为进一步阐明油酸致肝细胞脂肪变性机制提供理论依据,同时为动物脂肪肝的治疗提供一个新方向。1.油酸对BRL3A细胞损伤的影响为探究油酸对BRL3A细胞增殖、形态、脂滴生成和ATP含量的影响,本研究中首先采用CCK-8法、实时无标记细胞分析技术(RTCA)及油红O染色等方法,建立了 BRL3A细胞脂肪变性的模型;然后用扫描电镜及透射电镜观察油酸对细胞表面结构及超微结构的影响,用免疫荧光染色法观察细胞核、DNA及细胞骨架的变化;此外还用试剂盒检测TG及ATP含量的变化。结果显示:与对照组相比,1.8 mM油酸作用细胞24 h对细胞增殖无显著影响,细胞骨架、细胞核及细胞超微结构的损伤呈浓度依赖性;同时TG含量随油酸浓度增加显著性增加(P<0.05),但ATP含量随油酸浓度的增加显著性下降(P<0.05)。结果表明:油酸可致细胞形态损伤并发生脂肪变性。2.油酸致BRL 3A细胞脂肪变性机制的研究为探究油酸致BRL 3A细胞脂肪变性的机制,用不同浓度的油酸(0、1.2、1.8、2.4 mM)处理细胞24h,然后检测了 MDA、ROS的含量及抗氧化酶GSH-PX、T-SOD、CAT、T-AOC的活力;同时检测了 MAPK/TLR4/PPARγ通路蛋白的磷酸化情况和脂肪合成相关蛋白FAS、SREBP-lc的表达;另外,为进一步探究MAPK通路对TLR4蛋白的影响,1.8 mM油酸分别与MAPK信号通路相关抑制剂和TLR4的抑制剂共处理细胞后检测TLR4、FAS和SREBP-lc的表达情况及PPARγ的磷酸化水平。结果显示:与对照组相比,随油酸浓度增加,ROS和MDA的含量及CAT的活力显著增加(P<0.05),而GSH-PX、T-AOC、T-SOD活力显著下降(P<0.05);另外,脂肪合成相关蛋白及MAPK信号通路相关蛋白磷酸化水平显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01)。油酸与MAPK抑制剂共处理后TLR4表达水平显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01),油酸与TLR4抑制剂共处理后脂肪合成相关蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。结果表明:油酸可以引起BRL3A细胞发生氧化应激并激活MAPK信号通路,进而激活TLR4和PPARγ来增加脂肪合成相关蛋白FAS和SREBP-lc的表达,加剧脂肪变性的程度。3.生物素在油酸致BRL 3A细胞毒性损伤中的作用为探究生物素在油酸致BRL3A毒性损伤中的作用,本研究中采用CCK-8法、实时无标记细胞分析技术(RTCA)、油红O染色、电镜、免疫荧光法以及检测试剂盒等方法观察生物素对油酸引起的细胞毒性损伤的影响。结果显示:油酸与生物素共处理组与油酸单独处理组相比,细胞增殖指数上升,脂滴数量减少,细胞核及细胞骨架趋于完整。结果表明,生物素可显著改善油酸引起的细胞毒性损伤。4.生物素在油酸致BRL 3A细胞脂肪变性中的保护作用为探究生物素在油酸致BRL 3A脂肪变性中的保护机制,用80 μM生物素与1.8 mM油酸共处理细胞24 h,检测MDA和ROS的含量及抗氧化酶GSH-PX、T-SOD、CAT、T-AOC的活力;同时检测脂肪合成相关蛋白FAS、SREBP-1c的表达情况及MAPK/TLR4/PPARγ通路相关蛋白的磷酸化水平;为了进一步验证PPARγ在其中的作用,用油酸与PPARy激动剂ROZ和抑制剂T007共处理细胞后检测脂肪合成相关蛋白的表达。结果显示:生物素和油酸共处理组与油酸单独处理组相比,MDA和ROS的含量显著降低(P<0.05)而抗氧化酶GSH-PX、T-SOD、CAT及T-AOC的活力显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01);Western blot结果显示,TLR4的表达以及PPARγ和MAPK通路相关蛋白的磷酸化水平显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01);油酸与PPARγ激动剂ROZ共处理组与油酸单独处理组相比,显著增加脂肪合成相关蛋白FAS、SREBP-1c的表达(P<0.05);而油酸与PPARγ抑制剂T007共处理组与油酸单独处理组相比,则显著降低了脂肪合成相关蛋白FAS、SREBP-1c的表达(P<0.05)。结果表明,生物素可增强细胞的抗氧化能力,减少ROS的产生,同时可显著下调脂肪合成相关蛋白的表达,减轻细胞的脂肪变性程度。