论文部分内容阅读
落叶松（Larix spp.）是重要的速生造林树种，目前其体细胞胚胎发生作为一种新的繁殖技术已取得突破性进展。然而，胚性细胞诱导困难、畸形胚的出现和同步化困难等还是胚性细胞诱导过程中尚待解决的瓶颈问题，而分子机制的研究可能给体细胞胚胎发育带来新的变革。目前体细胞胚胎发育相关基因基因已经克隆到多个，但是大多数都是在体细胞胚胎发育后期起作用，SERK1是目前为止唯一发现在体细胞胚胎发育前期起作用的基因。SERK1基因是体胚发生早期的重要基因，因此研究落叶松SERK1基因在落叶松体细胞胚胎发生过程早期由愈伤组织转变为胚性细胞的过程中所起的作用对于落叶松体细胞胚胎发生的研究具有重要意义。本研究从体细胞胚胎发生相关受体类蛋白激酶SERK1入手，克隆了日本落叶松（Larix leptolepis）体细胞胚胎发生相关受体类蛋白激酶基因LaSERK1，对其进行了表达模式分析和原核表达并进行了抗体制备。主要研究结果如下：（1）克隆了落叶松体细胞胚胎发生相关受体类蛋白激酶LaSERK1基因，并将其翻译为蛋白后与其他物种SERK1进行了一级结构和高级结构比对，比对后发现它们有高度相似性；（2）qRT-PCR结果显示胚性细胞在含有脱落酸（Abscisic acid, ABA）激素的成熟培养基中培养时，LaSERK1在体胚发生早期高表达，但是在第七天时明显降低，之后的各阶段基本呈递减趋势。这些结果表明LaSERK1可能在落叶松体胚发育早期起重要作用；（3）当胚性细胞在无激素简单继代培养基中生长时，LaSERK1基因的表达比在含有2,4-D和BA的继代培养基中培养的细胞低很多，说明激素2,4-D和BA对LaSERK1基因的表达有一定的诱导作用；（4）构建了pSuper1300-GFP-LaSERK1亚细胞定位载体，证明LaSERK1定位在细胞膜上的，这也与其作为受体的功能相对应；（5）构建了LaSERK1蛋白胞外段原核表达载体pET28a(+)-His-ecLaSERK1，在体外对LaSERK1蛋白胞外段结构域进行了原核表达，并以此肽段为抗原制备了相关抗体，使用ELISA技术对其抗体进行了效价检测，得到较好的结果（效价1:2500），日后可以将此抗体用于对体细胞胚胎发育过程中各阶段LaSERK1蛋白表达量的Western blot检测以及用于免疫组化实验以研究体细胞胚胎发育过程中各阶段LaSERK1蛋白在胚团和成熟胚中的表达位置。综上所述，LaSERK1可能在落叶松体胚发育早期起重要作用，且在体胚发育过程中受ABA，2,4-D等激素的调控，LaSERK1也有可能成为早期胚性细胞的标记基因，且表达在细胞膜上，说明其在细胞感受外界信号过程中起作用。