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肿瘤的发生是一个多基因参与的过程,其一个重要起因是肿瘤细胞的异常增殖,而在细胞体内存在组蛋白乙酰化和去乙酰化之间的动态平衡,已有研究表明,两者之间平衡的失调将导致某些特定基因表达异常,促进肿瘤细胞增殖,进而加速肿瘤的发生发展。研究显示蜂毒素能够抑制组蛋白去乙酰化酶,而蜂毒素是一种从蜂毒中提取的水溶性多肽,是其重要组成成分及活性成分,其具有抗肿瘤活性,但其具体的作用机制未明。为了进一步探讨蜂毒素的抗肿瘤作用机制,本文主要从体外观察蜂毒素对HepG2细胞增殖的影响,并探讨其部分作用机制。研究内容由以下四个部分组成。1.蜂毒素对HepG2细胞增殖的影响。实验以人肝细胞癌HepG2细胞为研究对象,分为阴性对照组,蜂毒素组(1,4and8μg/ml)和阳性对照组(TSA)。MTT法检测蜂毒素对HepG2细胞活力的影响,流式细胞术检测蜂毒素对细胞周期的影响,及Western blot和RT-PCR检测细胞周期因子CyclinD1和CDK4的表达。实验结果表明,蜂毒素对HepG2细胞的增殖具有抑制作用,并呈浓度依赖性,同时周期G0/G1期细胞数随浓度上升,而S期细胞数则逐渐减少。蜂毒素对细胞增殖的抑制阻止在细胞周期的G1/S期,并且细胞周期因子CyclinD1和CDK4的表达逐渐降低。由此说明,蜂毒素具有抑制HepG2细胞增殖的作用。2.蜂毒素恢复PTEN的表达及降低其下游Akt的磷酸化水平。实验分组同上。Real-time PCR方法检测PTEN的mRNA的表达,Western blot检测PTEN、p-Akt蛋白的表达。实验结果表明,与阴性对照组比较,蜂毒素上调PTEN的表达,同时降低了磷酸化Akt的表达。由此说明,蜂毒素抑制细胞增殖的作用可能与其上调了PTEN的表达有关。3. HDAC2参与调控PTEN表达的机制研究。1)HDAC2siRNA沉默:根据HDAC2设计并合成siRNA,通过脂质体转染到HepG2细胞内,实验分为阴性对照组,Scramble siRNA组和HDAC2siRNA组。RT-PCR检测HDAC2和PTEN的mRNA的表达,Western blot检测HDAC2、ac-H3、PTEN和p-Akt的蛋白的表达。实验结果显示,与阴性对照组比较,靶向沉默HDAC2后PTEN的表达显著上调,降低磷酸化Akt的表达,并促进组蛋白H3的乙酰化,而Scramble siRNA组各基因的表达无显著差异。2)HDAC2重组质粒的过表达:实验分为阴性对照组、空载体组、HDAC2质粒组。Real-time PCR方法检测PTEN mRNA的表达,Western blot检测PTEN、p-Akt和ac-H3蛋白的表达。实验结果显示,与阴性对照组比较,HDAC2过表达后PTEN的表达显著下降,磷酸化的Akt的表达增高,并抑制组蛋白H3的乙酰化,而空载体组各基因的表达无显著差异。上述结果表明HDAC2参与了PTEN基因表达的调控。4.蜂毒素对HDAC2的调控作用研究:实验分为阴性对照组,蜂毒素组(1,4and8μg/ml)和阳性对照组(TSA)。Real-time PCR方法检测HDAC2mRNA的表达,Western blot检测HDAC2和ac-H3蛋白的表达。结果显示,蜂毒素下调HDAC2的表达,并且上调乙酰化H3的表达。综上所述,蜂毒素下调HDAC2的表达,上调PTEN进而抑制下游Akt通路的激活,抑制HepG2细胞增殖。