细菌通过设计精巧的蛋白传输系统,泌出毒性因子和效应子,与寄主进行分子交流。其中,Ⅱ型分泌系统广泛存在于革兰氏阴性细菌中。Ⅱ型分泌系统主要以分泌途径转膜蛋白(GSP)基因簇为中心。植物细菌性青枯病是我国和世界范围内广泛分布和发生的一种重要细菌病害,青枯菌Ⅱ型分泌系统与致病蛋白的分泌密切相关。本研究利用酵母双杂交技术,对青枯菌GMI 1000菌株Ⅱ型分泌系统Gsp蛋白之间的互作关系进行了分析研究。 根据青枯菌Ⅱ型分泌系统中12个gsp基因的上下游序列,利用引物设计软件,设计出12对最佳gsp基因扩增引物。克服了gsp基因GC%含量偏高(67.1-74.4%)、难以获得扩增产物的困难,通过PCR体系条件优化,成功地完成了青枯菌GMI 1000菌株Ⅱ型分泌系统12个gsp基因的克隆。 分别将12个gsp基因连接到酵母双杂交研究体系的诱饵载体pGBKT7及捕获载体pGADT7上,成功地构建了gsp基因诱饵库和捕获库。经过序列测定,证明12个gsp基因读框正确,保障了gsp基因在酵母体系中正确的表达。 成功地将诱饵库和捕获库共转化到AH109酵母菌株中,发现在酵母双杂交体系中,Gsp L和Gsp E;Gsp L和Gsp M;Gsp G和Gsp E;Gsp C和Gsp L及Gsp I和Gsp J蛋白之间可能存在相互作用。经载体互换后,证实了Gsp L和Gsp E;Gsp L和Gsp M;Gsp G和Gsp E蛋白之间互作的真实性。 本研究首次将酵母双杂交技术引入到青枯菌Ⅱ型分泌系统Gsp蛋白的互作研究中,实验得到了三对蛋白间的互作结果,证明该技术在青枯菌Gsp蛋白互作关系研究中的可行性。人类致病细菌Ⅱ型分泌系统中Gsp L-Gsp E-Gsp M-Gsp N-Gsp F在细胞内膜以复合物形式存在,构成组装其他分泌元件的平台。青枯菌Gsp蛋白互作分析与上述研究结果一致。 围绕青枯菌致病蛋白分泌密切相关的Ⅱ型分泌系统的研究,将为解析致病蛋白的分泌调控途径,寻找阻断青枯菌致病蛋白分泌的作用靶标,开辟控制青枯病危害的新途径奠定理论基础。