论文部分内容阅读
近年，脂肪酶作为生物催化剂，应用于药品，食品，化妆品等工业以及新能源开发如生物柴油上的重要价值引起了广泛的关注。丝状真菌被认为是目前最佳的脂肪酶的生产菌株之一，是脂肪酶的优良来源。烟曲霉作为丝状真菌中的一种，在自然界中分布广泛，根据NCBI网站上公布的基因组全序列预测烟曲霉含有约150个脂肪酶基因序列。
本文以烟曲霉脂肪酶基因作为研究对象，分别从DNA水平和cDNA水平克隆构建脂肪酶基因，筛选新型脂肪酶。根据NCBI上预测的烟曲霉脂肪酶基因序列设计引物，以基因组DNA或cDNA作为模板进行PCR扩增，将目的基因构建在PET28a表达载体上.转化至Escherichia coli BL21(DE3)进行表达，获得重组蛋白并进行活性分析。
本研究在DNA水平上共构建烟曲霉脂肪酶基因表达载体29个。在IPTG浓度为0.2mM，温度15℃(15 h)表达条件下，AFL1-1，AFL6-1，AFL31，AFL33和AFL36分别以p-NP acetate(C2)，C2，p-NP butyrate(C4)，C2和C2为底物测活，活性分别达到3.17×106U/1，134.2U/1，2532.3U/1，924.32U/1和360.98U/1。其中AFL1-1对C2具有显著活性，进一步通过同源比对和定点突变技术，推断其活性中心组成为Ser-165，Asp-260，和His-290。
cDNA水平成功构建烟曲霉脂肪酶基因5个。AFL67和.AFL26在IPTG浓度为0.2 mM，温度15℃下诱导表达15 h后，分别以p-PN hexanoate(C6)和C4为底物测活，活性分别可达4.74×104U/1和1.22×105 U/1。其中AFL67可手性拆分2-乙酰氧基苯乙酸(APA)生成高光学纯度(S)-扁桃酸((S)-MA)。
AFL67经重组表达后获得大小为41 kDa的重组蛋白，全细胞在30℃下催化APA，可生成高光学纯度(S)-MA(eep＝91.9％)。AFL67催化邻氯乙酰氧基苯乙酸和对氯乙酰氧基苯乙酸的选择性要优于催化间氯乙酰氧基苯乙酸的选择性。AFL67纯化后比活可达449 U·mg-1，偏爱催化短链和中链对硝基苯酚酯，可在pH7.5，15℃下发挥最佳活性，在10-25℃保温30 min以及在pH6.0-9.0范围内保温16 h(4℃)活性均能保持相对稳定。研究表明，AFL67并不属于金属酶，10％的乙醇和异丙醇可使其活性分别升高47％和50％。