目的1.构建NEP1-40基因工程神经干细胞（Neural stem cell,NSC）,探究其自身分化的潜能以及对成熟神经元轴突生长的调节作用;2.通过检测NEP1-40过表达对Rho A/ROCK信号转导通路下游关键调控因子的影响,明确NEP1-40-NSCs促进轴突再生的机制,为脊髓损伤（Spinal cord injury,SCI）的治疗提供理论依据。方法1.NEP1-40基因过表达载体的构建:检索已知大鼠的NEP1-40基因序列,合成引物,通过PCR方法扩增NEP1-40基因;将扩增的NEP1-40基因与酶切线性化的载体pc DNA3.1（+）进行定向连接后转化E.coli DH 5α感受态细胞;利用PCR技术对长出的克隆先进行菌落鉴定,然后对PCR鉴定结果为阳性的克隆进行双酶切鉴定及测序验证;将构建成功的质粒转染原代神经干细胞,分别采用RT-PCR、Western Blot和ELISA方法检测NEP1-40在转录、翻译水平及细胞外的表达情况。2.NEP1-40-NSCs的培养、分化及鉴定:提取孕20天SD大鼠的胎鼠原代神经干细胞并采用悬浮培养技术进行培养、传代,应用免疫荧光染色方法行Nestin鉴定;并用不同分化培养基诱导其贴壁分化,行Tuj-1、GFAP、Oligo2及MBP免疫荧光染色对其分化潜能进行鉴定,在免疫荧光显微镜下观察染色结果,同时采用RT-PCR、Western Blot实验方法检测Tuj-1、GFAP、Oligo2及MBP在转录和翻译水平的表达。3.NEP1-40-NSCs与大鼠海马组织神经元共培养:实验设计NEP1-40-NSCs为实验组,NSCs组为对照组,以1n M浓度Nogo-66干预,共培养5天后行β-tubulinⅢ免疫荧光染色检测,测量各组大鼠海马组织神经元轴突新增面积,Phalloidine染色观察生长锥及丝状伪足结构;采用Western Blot方法检测轴突及树突再生的标记物如生长相关蛋白43（Growth-associated protein 43,GAP-43）、微管相关蛋白2（Microtubule-associated protein 2,MAP-2）、淀粉样蛋白βA4（AmyloidβA4,APP）的相对表达量;对Rho A/ROCK信号转导通路下游多种调控生长锥的蛋白质底物包括LIMK1,LIMK2,Cofilin以及MLCⅡ在蛋白质水平、磷酸化程度方面进行检测。结果1.经测序和双酶切验证成功构建NEP1-40基因过表达载体,转染NSC后检测NEP1-40在转录和翻译水平的表达量及细胞培养液中的NEP1-40表达量,NEP1-40-NSCs组均显著高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。2.SD大鼠原代NSCs采用悬浮培养技术进行培养、传代,3天后镜下可见大小不一的细胞球形成,长至第7天时检测所有的神经球Nestin表达阳性,达到NSC的鉴定标准;诱导分化实验结果显示,NEP1-40-NSCs组Tuj-1、Oligo2及MBP所标记的阳性细胞数明显高于对照组（P<0.05）,然而GFAP标记的阳性细胞数低于对照组（P<0.05）,该结果与RT-PCR以及Western Blot检测结果一致。3.NEP1-40-NSCs与大鼠海马组织神经元共培养发现NEP1-40-NSCs组的轴突新增面积明显大于NSCs组,差异具有统计学意义（P<0.05）;Phalloidine染色能够观察到与NSCs组相比,NEP1-40-NSCs组的生长锥面积增宽,伪足数量增多且长度增加（P<0.05）;Western Blot检测轴突再生的标记蛋白相对表达量,结果显示NEP1-40-NSCs组GAP-43、MAP-2蛋白相对表达量上调,而APP蛋白相对表达量下调（P<0.05）;与NSCs组相比,Rho A/ROCK通路下游的关键调控因子LIMK1,LIMK2,Cofilin和MLCⅡ的磷酸化程度均明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论1.本研究成功构建NEP1-40基因工程NSCs,在转录和翻译水平以及细胞外均检测到NEP1-40因子的大量表达。2.NEP1-40-NSCs在体外能够诱导分化为神经元和神经胶质细胞,并显著提高大鼠海马神经元细胞的存活率。3.NEP1-40-NSCs能够克服Nogo-66的抑制作用,促进与其共培养的海马组织神经元轴突的延长,影响生长锥的结构发育,并且其作用机制可能是通过调控LIM激酶,Cofilin和MLCⅡ的磷酸化水平实现促进轴突生长从而实现修复脊髓损伤的效果。