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猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）主要ORFs的克隆与表达 猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是圆环病毒科圆环病毒属成员，分为Ⅰ型（PCV1）和Ⅱ型（PCV2）两个型，其基因组为共价闭合环状的单链DNA，大小约1.7kb。其中PCV2被疑为断奶猪多系统衰竭综合征（Postweaning pigs multisystemic wasting snydrome，PMWS）的病原。 目前国内外对PCV2的研究主要集中在其复制及与其他病原相关致病性上，在对病毒蛋白研究方面，除了对ORF1（复制相关蛋白Rep）和ORF2（衣壳蛋白Cap）的编码蛋白和功能研究较多之外对其它潜在ORFs编码蛋白研究较少。 为了建立快速、准确的PCV2的诊断方法，研制具有良好免疫原性的亚单位疫苗，首先设计并合成两对引物，通过PCR扩增出PCV2完整的ORF1（Rep）、ORF2（Cap）基因。利用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切获得Cap基因C端约400bp（ΔCap）片段。将这三种外源片段利用带有6×His残基的原核表达系统pPROHTb载体和带有谷胱苷肽-S-转移酶（GST）的pGEX-6p-1载体构建了重组质粒pPRO-Rep、pPRO-Cap，pGEX-PCV421-37（pGEX-ΔCap）在大肠杆菌中融合表达重组蛋白His-Rep、His-Cap、GST-ΔCap。将3种重组蛋白梯度浓度包被酶标板，与不同浓度的PCV2阳性血清和SPF猪阴性血清进行ELISA实验。三种重组蛋白与PCV2阳性血清均可发生反应，但反应强度不同，其中GST-ΔCap的反应原性最强，可用于PCV2的血清学诊断。pPRO-Cap、GST-ΔCap表达PCV2 ORF2的重组蛋白可作为PCV2亚单位疫苗的候选抗原。 国内外除对PCV2的Rep和Cap研究较多外，对其余的小的阅读框研究较少，为了了解PCV2病毒在复制过程中是否表达这些小的阅读框，进而研究其有何功能，设计并合成四对引物，通过PCR扩增出PCV2完整的ORF3、ORF4、ORF5和ORF6基因，构建了重组质粒pGEX-ORF3、pGEX-ORF4、pGEX-ORF5、pGEX-ORF6，在大肠杆菌中融合表达为重组蛋白GST-ORF3、GST-ORF4、GST-ORF5、GST-ORF6。 纯化这四种重组蛋白经免疫2kg体重的的健康新西兰兔制备兔高免血清，与PCV2超离病毒做免疫印迹试验，由抗GST-ORF3抗体可检测到与PCV2有特异性陈艳猪圆环病毒11型（PCV2）主要ORFs的克隆与表达2004年5月反应条带，证明在病毒复制过程中病毒可能表达ORF3编码的蛋白。此基因片段既不在Rep基因也不在CaP基因内，而是位于Rep基因互补链上的一段基因序列，其功能还需进一步研究。