胶质瘤是起源于神经外胚层的最为常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤,又称原始神经外胚叶肿瘤(primitive neuroectodermal tumors,PNET),占颅内肿瘤的40%左右,占神经上皮组织肿瘤的60%以上。胶质瘤呈浸润性生长,预后极差,其中50%为中位生存期仅1年左右的胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM),大部分胶质瘤仍需通过对细胞形态和侵袭程度进行诊断,治疗手段为手术切除,辅助放疗和化疗。胶质瘤的诊断分级以及与其他病变的鉴别十分困难。随着影像学技术MRI、CT等和穿刺活检技术的应用,在获取少量标本仅包含有限信息时通过组织病理学诊断十分困难,因此寻找胶质瘤特异性分子标志物,对于诊断及其治疗方案的选择具有十分重要的意义。2008年,Parsons等应用高密度寡聚核苷酸的微阵列对22例GBM进行全基因组分析发现大约70%低级别胶质瘤(Ⅱ和Ⅲ)和继发性胶质母细胞瘤(Ⅳ)患者的异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)基因活性位点的第395位碱基G发生突变,其中G395A(即R132H)最为常见,占90%以上。进一步研究发现,IDH1突变胶质瘤多为年轻患者,平均年龄为45岁,且突变型IDH1患者平均存活时间则约3年。由于免疫组化染色技术在临床病理诊断具有较高的准确度和灵敏度,2009年德国海德堡大学、美国杜克大学及2011年日本筑波大学三家研究机构分别制备特异性针对IDH1R132H单克隆抗体,并用于星形细胞瘤等免疫组织化学染色,为IDH1 R132H在不同级别神经胶质瘤中的表达及鉴别诊断,及临床的预后判断及靶向治疗提供了依据。制备识别携带某个氨基酸突变表位的单克隆抗体,首先是获得含有小肽的免疫原。通过化学合成含有氨基酸突变的小肽,偶联到钥孔血蓝蛋白(mcKLH;4.5×105-1.3×107Da)或牛血清白蛋白(BSA;67kD)等大分子,或通过合成DNA序列后与其他蛋白进行融合表达,由此获得免疫原。最后将上述含有小肽的蛋白免疫小鼠、杂交瘤技术和有限稀释法克隆化获得单克隆抗体。这种方法难以达到理想的针对小肽的免疫反应,筛选比较困难,因此得到的高亲和力单克隆抗体特异性有一定的困难。为了解决这一问题,本研究通过不同免疫策略的比较,利用腺病毒初免蛋白加强联合免疫方法(Adenovirus prime-Protein boost regimen,AP regimen)制备针对IDH1 R132H单克隆抗体,再对所获得的单克隆抗体进行鉴定的基础上,将之用于胶质瘤患者的组织染色。本课题的具体研究内容如下:(1)携带IDH1 R132H小肽和乙肝病毒核心抗原HBcAg融合蛋白的腺病毒E1穿梭载体pAd5/E1-CMV-HBcAg-IDHl R132H的构建:将合成IDHl R132H小肽克隆至实验室构建保存的含有乙肝病毒核心抗原HBcAg的腺病毒E1穿梭载体pAd5/E1-CMV-HBcAg,然后通过酶切鉴定及测序获得 pAd5/El-CMV-HBcAg-IDH1 R132H载体;(2)经IDHl R132H小肽修饰腺病毒衣壳蛋白Hexon高变区5骨架载体pAd5/E3-Luciferase-T2A-eGFP/Hexon HVR5-IDH1 R132H 的构建:通过一步法将IDHl R132H小肽连入实验室构建保存腺病毒骨架载体pAd5/E3-Luciferase-T2A-eGFP/HexonHVR5-LacZ 中,然后通过蓝白斑筛选、酶切鉴定及最后测序,获得经IDHl R132H小肽修饰腺病毒衣壳蛋白高变区5骨架载体pAd5/E3-Luciferase-T2A-eGFP/Hexon HVR5-IDHl R132H;(3)El区携带HBcAg-IDHl R132H且衣壳蛋白高变区5经IDHl R132H小肽修饰的重组腺病毒载体构建:将ScaI线性化的pAd5/El-CMV-HBcAg-IDHl R132H和 C/al 线性化的 pAd5/E3-Luciferase-T2A-eGFP/Hexon HVR5-IDHl R132H 共同转化转入BJ5183感受态细菌中进行同源重组,经过酶切和PCR鉴定及最终的测序,获得在El区携带乙肝病毒核心抗原与IDH1 R132H小肽融合蛋白并且在衣壳蛋白Hexon高变区5经IDHl R132H小肽修饰的重组腺病毒载体pAd5/El-CMV-HBcAg-IDHl R132H/E3-Luciferase-T2A-eGFP/Hexon HVR5-IDH1 R132H;(4)重组腺病毒 Ad5/E3-Luciferase-T2A-eGFP/Hexon HVR5-IDHl R132H 及Ad5/E 1-CMV-HBcAg-IDH 1 R132H/E3-Luciferase-T2A-eGFP/Hexon HVR5-IDHl R132H的制备、纯化及鉴定:将上述2种重组腺病毒载体分别经PαcI酶切后转染HEK 293细胞,10天左右收获病毒原液,大量扩增后经CsCl梯度密度离心得到纯化的腺病 Ad5/El-CMV-HBcAg-IDHl R132H/E3-Luciferase-T2A-eGFP/Hexon HVR5-IDH1 R132H 和 Ad5/E3-T2A-Luciferase-eGFP/HexonHVR5-IDHl R132H。通过观察eGFP的表达及体内外Luciferase活性测定鉴定所获得的重组腺病毒;(5)携带 HBcAg-IDHl R132H 小肽和 GranulinE-IDHI R132H 小肽融合蛋白原核表达载体的构建及其表达纯化:IDH1 R132H小肽连入BamHI和SfuI酶切实验室构建的pET-28a/HBcAg-LacZ BS载体,获得原核表达载体pET-28a/HBcAg-IDHl R132H。将IDH1 R132H小肽连接经Bg/Ⅱ和SfuI酶切pRSET-B/Grn E BS载体,获得pRSET-B/Gm E-IDH1 R132H原核表达载体。将上述两种原核表达载体分别电转化至Rossatta和BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋.白;(6)合成IDHlR132其他已报道的六种突变体小肽序列,克隆至pRSET-B/Grn E BS原核表达载体,分别电转至BL21(DE3)菌株,IPTG诱导后通过SDS-PAGE检测表达情况;(7)以实验室构建保存的pGEM-T/IDHl为模板,利用PCR构建R132H定点突变,连入pAd5/E1-CMV-Flag真核表达载体,检测在HEK293细胞中的表达;(8)针对人IDH1 R132H小肽单克隆抗体的制备、鉴定及应用研究。通过上述2腺病毒和原核蛋白免疫原的制备,设置了 5种免疫策略,通过比较免疫效价最终确定小鼠免疫方案:腺病毒 Ad5/E3-Luc-T2A-eGFP/Hexon HVR5-IDHI R132H 按照2×1010vp/只剂量肌肉注射免疫Balb/c小鼠3只,间隔1周后再由腺病毒Ad5/El-CMV-HBcAg-IDHl R132H peptide/E3-Luc-T2A-eGFP/Hexon HVR5-IDH1 R132H进行第二次免疫,1周后用HBcAg-IDHl R132H小肽融合蛋白与弗氏完全佐剂研磨后皮下多点注射,2周后尾静脉取血测定免疫效价。单克隆抗体的制备、鉴定及应用研究:HBcAg-IDHl R132H小肽融合蛋白腹腔注射加强免疫效价达64,000的免疫鼠,取脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合,以GrnE-IDHlR132H融合蛋白为包被抗原进行间接Elisa筛选,有限稀释法克隆化,获得阳性杂交瘤细胞,扩大培养及制备腹水后采用免疫印迹和免疫荧光染色对获得的抗体进行鉴定。最后将制备的IDH1 R132H抗体用于胶质瘤患者石蜡组织切片染色,并与商业化H09抗体在特异性上进行了比较。通过上述研究获得以下研究结果:(1)成功制备两种携带IDHl R132H小肽重组腺病毒载体,即pAd5/El-CMV-HBcAg-IDHl R132H/E3-Luc-T2A-eGFP/Hexon HVR5-IDHl R132H和 pAd5/E3-Luc-T2A-eGFP/HexonHVR5-IDHl R132H;(2)获得腺病毒疫苗经测定滴度均达到1012vp/ml,活力均达到109pfu/ml,Luciferase体内外活力良好;(3)成功构建原核表达载体pET-28a/HBcAg-1DH1 R132H、pRSET-B/Grn E-IDH1 R132H 和 pRSET-B/GrnE-IDHlR132 mutants(C/S/G/L/V/P)并诱导表达,并纯化了 IDHl R132H 小肽融合蛋白 HBcAg-IDHl R132H 浓度为 0.52 mg/mL,Grn E-IDHl R132H浓度为1.6 mg/mL;成功构建了真核表达载体pAd5/El-CMV-IDHl R132H-Flag,并在可在HEK293细胞中正常表达;(4)采用联合免疫,通过杂交瘤技术制备获得针对IDH1 R132H抗体5株,经Western blot免疫荧光染色鉴定,其中4株特异性针对IDHlR132H(1D6、2B11、3C6和4F5),1株2D7针对野生型IDH1;经过进一步验证4F5同时对R132L和R132V交叉反应;1D6对R132L交叉反应;另2株(2B11、3C6)仅特异性识别R132H。(5)临床确诊的IDHl R132H阳性胶质瘤和野生型IDH1胶质瘤病理石蜡切片的组化染色,结果显示制备的IDHl R132H单克隆抗体可应用于IDH1突变胶质瘤的诊断。上述研究结果为胶质瘤诊断提供了特异性抗体,为深入研究IDH1 R132H在胶质瘤中的作用机制奠定了重要基础;同时也为小肽单克隆抗体制备提供一种新的可行有效的免疫方案。