[背景]肿瘤的发展过程可分为无血管的缓慢生长阶段和有血管的快速生长阶段,在无血管阶段肿瘤细胞主要依靠邻近的血管系统获得氧和营养物质,并运走代谢产物,此时肿瘤的体积很少超过1—2mm3。随着肿瘤的生长邻近血管系统的供给已不能满足肿瘤细胞的生长需求,肿瘤细胞通过合成分泌促血管生长因子参与肿瘤血管的生成,以形成新的微血管网络满足肿瘤细胞的生长需要。因此,抗肿瘤血管生成为抑制肿瘤生长的重要策略。血管内皮生长因子(vascular endothelia growth factor,VEGF)作为最主要的血管生成因子,能促进血管的形成,提高血管的通透性,刺激肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管,从而促进肿瘤的生长与转移。目前,VEGF单克隆抗体在临床抗肿瘤血管生成治疗中已获得应用。成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)同样具有显著的促肿瘤血管生成活性,是临床靶向VEGF治疗耐药性产生的重要原因。近年发现,肿瘤血管异常,在肿瘤免疫抑制微环境形成与发展中发挥了关键作用。[目的]构建VEGF和FGF-2基因重组疫苗,探讨疫苗主动免疫策略诱导持续存在的特异抗体、拮抗肿瘤组织中过表达的VEGF和FGF-2,从而抑制肿瘤生长的潜能,为临床抗肿瘤血管生成治疗及肿瘤微环境免疫调控提供新的手段。[方法]利用基因工程方法将小鼠VEGF表位以及FGF-2全长成熟蛋白序列重组于乙肝核心抗原(HBcAg)和噬菌体Qβ载体蛋白中,并与单独的载体蛋白共表达;经硫酸铵沉淀、蔗糖密度梯度离心、电镜观察、HPLC凝胶过滤层析等方法纯化和鉴定颗粒性质。将纯化制备的HBcAg-VEGF和QP-VEGF病毒样颗粒以及QP-FGF-2蛋白皮下免疫小鼠,以ELISA检测特异抗体水平。以预防性免疫策略在4T1乳腺肿瘤模型中考察对肿瘤生长与转移的影响。研究考察小鼠肿瘤动态生长情况,在实验终点牺牲小鼠,称量小鼠肺和肿瘤质量,计数肿瘤肺部转移结节数,并分离脾细胞,以ELISPOT检测表达IFN-γ的脾细胞数目。以治疗性免疫策略在TC-1细胞移植HPV感染肿瘤模型中考察抗VEGF主动免疫对肿瘤生长叠加抗原特异治疗性疫苗抗肿瘤生长作用的影响。研究考察小鼠肿瘤动态生长情况,在实验终点牺牲小鼠,称量小鼠肿瘤质量,并分离脾细胞,以流式细胞术检测CD8+细胞水平。[结果]分别构建了 HBcAg-VEGF、Qβ-VEGF、HBcAg-FGF-2 和 Qβ-FGF-2与各自载体蛋白共表达的重组质粒。在大肠杆菌BL21中成功诱导了目的蛋白的表达,其中HBcAg-VEGF和Qβ-VEGF能折叠形成嵌合VLPs,而QP-FGF-2主要以包涵体的形式存在。将纯化的HBcAg-VEGF、Qβ-VEGF VLPs和经变性复性的可溶性蛋白QP-FGF-2皮下免疫小鼠均获得了特异性的抗体应答。在预防性免疫干预中,与模型小鼠及载体免疫对照组小鼠相比较,抗VEGF与FGF-2主动免疫抑制了原位乳腺肿瘤4T1的生长与肺转移;进一步的免疫学检测显示,抗VEGF与FGF-2免疫促进了 IFN-γ表达的脾细胞数。在治疗性免疫干预中,抗VEGF主动免疫协同HPVE7特异治疗性疫苗,抑制了 TC-1移植肿瘤的生长,同时增加了小鼠脾细胞中CD8+淋巴细胞比例。[结论]通过抗原嵌合蛋白与载体蛋白的共表达可以有效促进呈现VEGF抗原的病毒样颗粒形成、增强抗原免疫原性。靶向VEGF和FGF-2的疫苗能激发小鼠特异抗体应答,抑制小鼠肿瘤生长和转移,有希望成为肿瘤免疫治疗的有效手段。[背景]2014年埃博拉在全球范围内爆发,截止2015年7月全球感染人数高达27741人。由于其传播迅速,致死率极高,美国国立卫生研究院将其列为A类病原体。尽管埃博拉的爆发存在一定的地域限制,但是随着国际交流的增加,使得对于埃博拉的相关的检测、治疗手段和疫苗的研发变得更加迫切。病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)具有病毒的形态结构,但没有复制能力,能激发机体产生特异性应答,可作为更为安全有效的疫苗形式。[目的]在哺乳动物293FT细胞中制备基因重组埃博拉病毒样颗粒,为疫苗研究及埃博拉病毒特异抗原、抗体检测提供基础。[方法]根据埃博拉病毒扎伊尔株的GP和VP40蛋白氨基酸序列,以哺乳动物细胞基因表达密码子偏好性进行基因优化设计;化学合成GP和VP40基因片段并分别构建于表达质粒pcDNA3.1或同时构建到具有双表达单元的质粒pBudCE4.1;重组质粒经 lipofectamine2000 转染 293FT 细胞;以 Western blot 检测重组蛋白GP和VP40的表达;通过电镜观察病毒样颗粒。[结果]构建的重组质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建成功;Western blot结果显示,共转染分别表达GP和VP40的两个质粒或转染共表达两个蛋白的质粒都发现GP特异反应条带产生,且大小与预期相符,此外,转染共表达质粒产生的GP蛋白表达明显强于两个质粒共转染,并同时可检测到VP40的表达;电镜观察到典型的丝状的埃博拉病毒样颗粒。[结论]在293FT细胞中基因优化的埃博拉病毒GP和VP40可有效表达并装配为病毒样颗粒,为进一步研究奠定了基础。