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甘草主要来源于豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch的干燥根和根茎,是临床最常用的大宗药材之一。现今国家明令禁止采挖野生甘草,栽培品中存在甘草酸含量不达药典标准的问题,给甘草药材的市场流通和成药的制剂生产带来一定的影响。为了提升甘草药材的质量,人们通过各种手段试图解析甘草酸含量积累和变化机制,包括产地、栽培技术、遗传学等方面的研究,均取得一定的成绩,但仍无法提高栽培品种的甘草酸含量。本课题通过大量文献查阅发现植物中次生代谢产物的生成途径不是孤立存在的,各个代谢途径间存在密切关系,以共同底物为节点集结成网。基于以上发现,本文提出如下假说,甘草体内存在调控甘草酸含量的核心化学成分网络。本文试图在甘草体内发现代谢途径相互影响的网络关系,通过调控网络内其它代谢途径使甘草酸的含量升高。本研究通过建立高甘草酸含量模型的方法,采用超高效液相色谱-电喷雾-质谱/质谱法(UPLC-ESI-MS/MS)和高效液相色谱法(HPLC)定量分析次生代谢产物含量,并使用统计学软件进行分析,得到可能影响甘草酸含量的次生代谢产物。本研究又通过外源施加脱落酸(ABA)和甘草苷,明确其与甘草酸含量变化的关系,从而证明甘草酸、ABA和甘草苷含量之间存在正相关关系,为阐述甘草酸的合成机制及提高甘草药材的质量提供一定参考依据。本课题共获得了如下成果：(1)利用UPLC-ESI-MS/MS技术和HPLC技术建立了甘草中内源激素赤霉素(GA3)、ABA茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、生长素(IAA)和化学成分甘草酸、甘草苷、甘草素和异甘草素的定量分析方法,方法学考察均良好。尤其在内源激素的同时测定上,本研究将色谱分离时间缩短在4 min以内,前处理仅需使用C18固相萃取(SPE)小柱纯化样品；同时选择肉桂酸(CA)作为内标物,相比于同位素内标更具可操作性和经济优势,回收率和基质效应实验结果证明其能达到准确定量的目的,优化了药用植物中次生代谢产物同时测定的方法。(2)采用根部浸泡以及根部施加甘草酸的方法,在甘草中建立了72 h和45 d的高甘草酸含量模型。72 h甘草酸根部浸泡实验结果表明,甘草酸的含量较初始值和对照组的明显升高,高浓度刺激时,组内甘草酸含量72 h内最快上升幅度48.5%,最慢17.3%；45 d甘草酸根部施加实验结果表明,高浓度刺激时7d内上升幅度为32.2%,7d后甘草酸含量降低,45 d内上升幅度仍为12.8%。上述结果说明高浓度1.0mmol·L甘草酸根部施加造成的高甘草酸含量是可行的,并且是能够保持的。(3)在甘草中模拟高甘草酸含量时,各次生代谢产物中受到影响最明显的是甘草苷和ABA,以高浓度组1.0mmol·L-1刺激时影响最显著。72 h根部浸泡结果显示72 h内甘草苷含量上升79.3%；ABA含量在48 h和72 h时急速上升,72h增幅达到293%。45 d根部施加结果显示45 d内甘草苷含量上升185%；ABA含量增幅在15 d时达到369%。相关性分析结果证明了甘草酸-甘草苷、甘草酸-甘草素、甘草酸-异甘草素和甘草酸-ABA之间的影响作用,其中与甘草酸含量关联性最大的激素成分为ABA,化学成分为甘草苷,甘草酸含量与ABA、甘草苷、甘草素、异甘草素的含量均呈显著的正相关。(4)在甘草中模拟高ABA含量时,各次生代谢产物中受到影响最明显的仍是甘草酸和甘草苷。以高浓度组计,45 d外源施加实验结果显示,甘草酸和甘草苷的含量在30d时分别达到最高值,增幅达到52%和392%。相关性分析结果验证了ABA-甘草酸和ABA-甘草苷在分支上的影响作用,ABA含量与甘草酸、甘草苷的含量均呈显著的正相天。在甘草中模拟高甘草苷含量时,各次生代谢产物中受到影响最明显的是甘草酸、ABA和甘草素。以高浓度组计,45 d外源施加实验结果显示,甘草酸的含量7d内上升最快,上升幅度达到22%,45 d内涨幅为27%；ABA在7d时上升最快,上升幅度为327%。甘草素的含量变化与甘草苷呈现相反的趋势,一直持续下降,其中低浓度组的降幅在45 d内均超过高浓度组,45 d降幅达到45%,超过高浓度组降幅的36%。相关性分析结果验证了甘草苷-甘草酸和甘草苷-ABA在分支上的影响作用,甘草苷含量与甘草酸、ABA的含量均呈显著的正相关。(5)ABA和甘草苷的外源刺激能够提高甘草在传统认知和现代认知上的质量。使用ABA进行外源刺激时,45d内高浓度组a’值上升幅度达29.7%,b*值上升幅度27.7%；而使用甘草苷进行外源刺激时,45d内高浓度组a*值上升幅度达14.6%,而b*值上升幅度15.3%。对比自然状态下a*值和b*值6个月的上升幅度26.2%和10.1%,并结合前文含量测定数据,本研究得出结论：高浓度甘草苷和ABA的外源刺激,不仅能够提高甘草以颜色为指标的传统认知上的质量,同时也能提高以甘草酸、甘草苷含量为指标的现代认知上的质量。本研究基于高甘草酸含量模型方法,明确了ABA、甘草酸和甘草苷三者存在正相关,验证了甘草中存在化学成分网络的假说。为通过外施ABA或甘草苷来提高甘草酸的含量奠定理论依据。