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雌激素受体(estrogen receptor,ER)是核受体超家族(nucleus receptor,NR)成员之一,可分成ERα和ERβ两个亚型。间充质干细胞能同时表达ERα和ERβ,且ERα表达占优势。作为人体硬组织新陈代谢的关键,ER能够被其主要配体雌二醇(17β-estradiol,E2)激活以调节细胞生长,增殖和分化。已有研究表明17β-雌二醇对人根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAPs)的成骨分化有促进作用。目前,ERα对SCAPs成牙/成骨分化能力的影响尚未有文献报道。第一部分 根尖牙乳头干细胞的分离培养及鉴定研究目的:获得纯化的根尖牙乳头干细胞。研究方法:经江苏省口腔医院患者的知情同意,获得临床上拔除的根尖孔未闭合的无龋第三磨牙,采用酶消化法进行根尖牙乳头干细胞的原代培养,并通过有限稀释法获得纯化的根尖牙乳头干细胞。倒置显微镜下观察细胞的形态及生长。流式细胞术(FCM)检测STRO-1、CD73、CD90、CD105等间充质干细胞表面相关标志物,以确定细胞来源。实验结果:根尖牙乳头干细胞为成纤维细胞形态,镜下观察为梭形;SCAPs阳性表达STRO-1、CD73、CD90、CD105等间充质细胞标记物,而CD45和CD34为阴性。结论:经鉴定,分离出的多克隆根尖乳头细胞为间充质来源干细胞。第二部分 ERα对SCAPs增殖与定向分化能力的影响研究目的:探讨ERα低表达及过表达对SCAPs的增殖及分化能力的影响。研究方法:ERα低表达(PLKO1和sh-ERα)和过表达组(GFP和ERα)病毒分别转染SCAPs,提取两组细胞总蛋白和RNA,蛋白免疫印迹实验(Westernblot)和实时定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)检测ERα/ERα表达情况。ERα低表达组及过表达组病毒分别转染SCAPs,采用CCK8绘制两组细胞生长曲线,流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布,计算细胞增殖指数(PI),检测ERα低表达及过表达对SCAPs增殖能力的影响。检测ALP活性,茜素红钙化结节染色,利用Real time RT-PCR和Western blot检测成牙/成骨相关指标(OSX,DMP1/DMP 1,DSPP/DSP,R UNX2/RUNX2,OCN/OCN)的变化,探讨 ERα低表达及过表达对SCAPs成牙/成骨分化能力的作用。实验结果:Real time RT-PCR和Western blot的实验结果表明:ERα低表达组中,ERα的蛋白及基因表达水平较对照组明显下降;ERα过表达组中,ERα的蛋白及基因表达水平较对照组显著升高。CCK8及FCM结果显示ERα低表达及过表达后SCAPs的增殖能力没有明显变化。ERα低表达组中,SCAPs的ALP活性下降,钙化结节形成量减少;ERα过表达组中,SCAPs的ALP活性增高,钙化结节形成量增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。ERα低表达组成牙/成骨标志基因及蛋白表达(OSX,DMP1/DMP1,DSPP/DSP,RUNX2/RUNX2,OCN/OCN)在 3d 或7d均较对照组显著降低;ERα高表达组成牙/成骨基因及蛋白表达在3d或7d均较对照组显著增高。结论:经检测,病毒转染效果显著。ERα低表达及过表达对SCAPs增殖能力没有明显影响。在ERα低表达状态下的SCAPs成牙、成骨能力明显下降;在ERα过表达状态下的SCAPs成牙、成骨能力明显上升,表明ERα调节SCAPs成牙/成骨向分化进程。第三部分 ERα调控SCAPs分化的MAPK通路机制研究目的:探讨MAPK通路在ERα调控根尖牙乳头干细胞分化过程中的可能作用。研究方法:ERα低表达组及过表达组病毒分别转染SCAPs,提取胞浆胞核蛋白,Western blot 检测 MAPK 通路相关蛋白(p-ERK,ERK,p-p38,p38,p-JNK,JNK)及通路下游相关转录因子表达情况。实验结果:ERα低表达及过表达情况下,JNK和ERK的MAPK信号通路被激活,而p38信号通路未激活,同时,下游的相关转录因子也被激活,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:ERα可通过MAPK信号通路促进根尖牙乳头干细胞的分化能力。