程序性细胞死亡可以分为I型细胞凋亡、II型细胞自噬及III型细胞程序性坏死。细胞凋亡在胚胎发育、免疫系统、组织内稳态和癌症等生理和病理状态中都发挥很重要的作用。在经典凋亡途径中，死亡受体通路及线粒体通路激活均可通过活化凋亡的执行者Caspases，介导关键蛋白的剪切，引起一串生化反应事件使胞内组分降解，介导细胞死亡。细胞凋亡具有典型的特征性表型，包括染色体凝集、凋亡小体、膜泡及DNA片段化等。为了提供能量和营养循环，细胞形成了一种进化保守策略—自噬，来降解长寿命胞质蛋白和细胞器，当受到饥饿、低氧、内质网应激和氧化应激等刺激时，细胞就会通过自噬进行促存活，使细胞免于死亡。然而当刺激超过某一极限时，会出现大量的自噬小泡，从而引发细胞自噬死亡，或称为Ⅱ型细胞死亡。　　程序性坏死虽属于程序性死亡，但却与凋亡和自噬均具有特殊的细胞死亡形态不同，程序性坏死的细胞形态与普通坏死完全相同，在死亡过程中细胞会发生质膜完整性丧失，细胞器及细胞发生肿胀，最后导致细胞溶解。　　TNFα在免疫紊乱和肿瘤发展的发病机制中发挥重要的作用，它可以诱导细胞存活、凋亡和程序性坏死。研究表明TNFα介导不同反应的关键取决于形成何种细胞内信号转导复合体。当TNFα与TNFR1结合后首先招募多种蛋白在胞膜区形成I型复合体，其中RIP1激酶在cIAPs的作用下发生K63泛素化修饰，介导NF-κB信号通路活化，促进细胞生存。而当RIP1在CYLD、A20或Smac模拟物(SmacM)作用下发生去泛素化修饰时，细胞内会形成诱导细胞死亡的II型复合体。其中由RIP1、FADD、Caspase-8及TRADD组成的复合体IIa，通过剪切活化Caspase-8，诱导细胞凋亡。而在RIP3激酶高表达的细胞中，当使用zVAD阻断Caspase的活性时，RIP1与RIP3会结合，形成complex IIb(又称为坏死复合体necrosome)，诱导细胞发生坏死。对比细胞凋亡和细胞坏死，通常Caspase抑制剂可以拮抗凋亡但促进坏死，而抑制RIP1激酶可以拮抗坏死但对凋亡没有影响。　　L929纤维肉瘤细胞建系于1948年，是一种在国内外实验室被广泛使用的细胞系。由于单独使用TNFα即可诱导细胞死亡的发生，因而L929细胞被广泛地应用于细胞死亡的实验研究。但在众多的实验报道中TNFα既可以诱导细胞凋亡，也可以诱导细胞坏死以及细胞自噬，提示该细胞系的生物学特征在不同的实验体系中可能并不相同。在前期的实验中发现来源于军事医学科学院基础医学研究所免疫研究室的L929细胞（命名为L929-A）虽已在先前的报道中被用于TNFα诱导细胞坏死的研究，但其细胞的死亡调控却呈现既不同于经典凋亡又不同于程序性坏死的特性，表现为RIP1激酶抑制剂Nec-1及泛Caspases抑制剂z-VAD均可拮抗TNFα诱导的细胞死亡，而敲低Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9或采用相关抑制剂却不能拮抗细胞死亡，且细胞呈现非凋亡的死亡形态。更进一步的研究发现L929-A细胞中存在由RIP1、Caspase-8和FADD蛋白组成的Ripoptosome复合体，且TNFα刺激后RIP1和Caspase-8之间的相互结合明显增强，进而介导产生RIP1激酶活性依赖的Bid剪切，与经典凋亡通路不同，RIP1激酶依赖的Bid剪切并非通过活化线粒体凋亡信号通路介导细胞死亡，本研究在此基础上围绕Bid剪切介导细胞死亡的分子机制展开。　　首先分别检测了TNFα对细胞生存率、细胞内活性氧（ROS）的生成及钙离子浓度的影响。结果显示TNFα可时间依赖地诱导L929-A细胞死亡，细胞死亡出现的时间点是6小时，同时伴随ROS及钙离子浓度的升高。采用Nec-1或敲低RIP1蛋白来抑制RIP1激酶活性可以有效拮抗TNFα的细胞毒性。敲低Bid蛋白同样可以完全拮抗TNFα的细胞毒性。　　随后通过胰蛋白酶浓度梯度消化法检测了RIP1、Caspase-8和Bid蛋白的表达和线粒体定位，结果显示RIP1、Caspase-8和Bid蛋白均定位在线粒体外膜上，提示线粒体可能是Bid蛋白的剪切位点。此外研究发现在TNFα处理后3小时，细胞尚未出现明显活性改变之前，伴随Bid蛋白剪切，线粒体呼吸链复合体III的活性受到抑制，线粒体膜电位下降，ATP水平开始降低。继而在TNFα处理6小时后出现胞内ROS和钙离子浓度显著上升，导致细胞死亡。这些研究结果证实线粒体呼吸链复合体III的活性受到抑制是介导细胞死亡的关键环节，由于敲低RIP1的表达或采用Nec-1抑制RIP1激酶活性以及敲低Bid蛋白均可以拮抗TNFα诱导的线粒体毒性，保护细胞免于死亡，进一步证实RIP1激酶依赖的Bid剪切恰恰是启动线粒体功能抑制和线粒体外膜通透性下降及ATP降低的诱因。　　本研究的主要发现是线粒体呼吸链复合体III功能抑制在TNFα诱导L929-A细胞非经典凋亡过程中的重要作用，明确了线粒体呼吸链复合体抑制会直接导致细胞供能受影响，影响线粒体膜电位稳定；同时排除了ROS和胞内钙离子水平的变化是细胞死亡诱因的可能性。综上所述，我们的研究进一步明确了TNFα诱导RIP1激酶依赖的Bid剪切介导L929-A细胞非经典凋亡的分子机制，为丰富RIP1依赖的凋亡信号通路调控提供了新的线索。　　结论： TNFα诱导的L929-A细胞死亡的分子机制涉及RIP1激酶依赖的Bid剪切，启动抑制线粒体电子传递链复合体complex III的功能、介导细胞能量代谢异常、线粒体膜通透性增加、ROS产生等系列反应，最终导致细胞死亡。