【摘 要】
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果实成熟,是指果实完成生长发育之后,发生一系列生理生化变化过程的集合,这一过程也是影响果实的采后品质以及贮藏时间的关键因素。梨是我国栽培面积最广的果树之一,梨果实因其具有甜美多汁,肉质细腻,皮薄个大等特点,受到消费者喜爱,作为呼吸跃变型水果,梨在成熟过程中会释放大量乙烯从而加快果实成熟,可见,乙烯是梨果实成熟的重要促进因子。人们为了提早或延长果实的成熟期,获得更大的经济效益,通常采取喷施乙烯利、1
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果实成熟,是指果实完成生长发育之后,发生一系列生理生化变化过程的集合,这一过程也是影响果实的采后品质以及贮藏时间的关键因素。梨是我国栽培面积最广的果树之一,梨果实因其具有甜美多汁,肉质细腻,皮薄个大等特点,受到消费者喜爱,作为呼吸跃变型水果,梨在成熟过程中会释放大量乙烯从而加快果实成熟,可见,乙烯是梨果实成熟的重要促进因子。人们为了提早或延长果实的成熟期,获得更大的经济效益,通常采取喷施乙烯利、1-MCP和冷藏保存等措施,这样不仅增加了生产成本,消耗大量资源,还对环境产生不良影响。因此挖掘调控果实成熟的关键基因,阐明梨果实成熟的分子调控机制和调控网络,对控制梨果实成熟过程,提高果实采后品质以及延长贮藏时间具有重要的理论和实践意义。梨果实成熟是涉及许多基因综合表达调控的结果,转录因子在其中发挥了重要作用。在本研究中,为了解析转录因子调控果实成熟的分子调控机制和调控网络,我们通过生物信息学和转录组数据分析,筛选到了参与调控果实成熟的HB和IAA基因,利用瞬时转化验证基因的功能,并通过分子生物学和细胞生物学实验发掘了它们的互作蛋白,进一步阐述了它们调控果实成熟过程中乙烯合成的分子机制,对于完善梨果实成熟的分子调控信号网络具有重要作用。其主要结果如下:1、以梨果实发育成熟各个时期HB家族的转录组数据为基础,用qRT-PCR进行验证,筛选到了一个HB家族成PbrHB.G7.2,发现其表达受到果实成熟的诱导。通过将PbrHB.G7.2在梨果实中进行瞬时转化、烟草中双荧光素酶报告实验、酵母单杂交实验和凝胶电泳迁移实验,发现PbrHB.G7.2可以直接结合并激活PbrACS1b的P9部分启动子（起始密码子前200-300bp）,提高其转录水平,从而加速乙烯的合成,促进果实成熟。经过酵母文库筛选、酵母双杂交实验以及烟草荧光素酶互补实验,我们找到了与PbrHB.G7.2蛋白互作的两个转录因子PbrHB.G1和PbrHB.2.1。为明确它们的互作区域,我们对PbrHB.G7.2、PbrHB.G1和PbrHB.2.1进行分段酵母双杂实验,发现PbrHB.G7.2的D+C段与PbrHB.G1和PbrHB.2.1的D段互作,烟草荧光素酶互补实验也验证了这一结果。接下来在双荧光素酶报告实验、酵母单杂交试验和凝胶电泳迁移实验中,发现PbrHB.G1能够直接结合并激活PbrACS1b的P16部分启动子（起始密码子前1700-1800bp）,而PbrHB.2.1同样能够直接结合并激活PbrACS1b的P17部分启动子（起始密码子前940-1060bp）,但是当PbrHB.G1和PbrHB.2.1与PbrHB.G7.2蛋白互作时,对于PbrACS1b的启动子的激活作用消失了。上述结果阐明了 PbrHB.G7.2能够调控梨果实成熟过程中乙烯合成的分子机制,明确了 PbrHB.G7.2及其互作蛋白PbrHB.G1和PbrHB.G2.1调控乙烯合成的分子网络。2、我们分离并鉴定了梨树中Aux/IAA基因,根据转录组数据分析了 Aux/IAA基因在梨果实发育成熟各个时期的表达水平,并用qRT-PCR进行验证,筛选到了一个在梨成熟果实成熟过程中的表达水平显著提高的Aux/IAA家族成员PbrIAA.C3。后期,通过将PbrIAA.C3在梨果实中瞬时转化,发现PbrIAA.C3基因的表达能够提高PbrACS1b的转录水平,产生更多的乙烯,加快果实成熟。双荧光素酶报告实验、酵母单杂交实验,发现PbrIAA.C3可以直接结合并激活PbrACS1b的P9部分启动子（起始密码子前200-300bp）。经过酵母文库筛选、荧光素酶互补实验和酵母双杂实验,我们找到了 PbrIAA.C3的互作蛋白PbrARF51。进一步地双荧光素酶实验发现,PbrIAA.C3与PbrARF51互作后抑制了PbrACS1b启动子的活性。总之,上述结果找到了调控果实成熟的Aux/IAA家族基因PbrIAA.C3,发掘了PbrIAA.C3的互作蛋白PbrARF51,揭示了 PbrIAA.C-PbrARF51蛋白复合体调控果实成熟过程中乙烯合成的分子机制。
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