背景:肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一,非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌的80%～85%。NSCLC的主要治疗方式是手术切除与化疗,对于那些多灶性及已复发或转移的NSCLC患者来说,化疗显得尤为重要。然而,传统化疗药特异性差、毒副作用强,临床应用受到一定限制。随着分子病理诊断技术的发展,基于肿瘤细胞特定分子变异的分子靶向治疗正逐渐成为恶性肿瘤治疗的主流。目前治疗NSCLC的分子靶向药中应用最多的是表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）。研究表明,亚裔女性非吸烟的肺腺癌患者为EGFR-TKI药物治疗的主要获益人群,且这些患者肿瘤细胞常携带EGFR第18、19或21外显子突变。然而,多数起初对EGFR-TKI敏感的NSCLC患者在接受该药治疗半年后会出现耐药,即发生了获得性耐药。因此,克服NSCLC的EGFR-TKI获得性耐药已成为临床亟待解决的问题。文献报道,与EGFR-TKI获得性耐药机制相关的分子变化主要有:EGFR第20外显子T790M突变;EGFR下游信号通路蛋白如PI3K基因突变;EGFR外信号通路如c-MET基因扩增及癌细胞上皮间质转化（EMT）等。其中T790M被普遍认为是NSCLC细胞对EGFR-TKI产生获得性耐药的分子基础。然而,我们前期发现携带有T790M的NCI-H1975细胞株和不携带T790M的NCI-H1650细胞株在经gefitinib剂量递增、间歇诱导产生获得性耐药后都出现了 EMT;而获得性耐药株NCI-H1975/GR接受X射线照射发生耐药逆转后细胞却发生了相反的间质上皮转化（MET）。这提示EMT可能是NSCLC细胞逃避EGFR-TKI攻击并发生获得性耐药的共同机制。因而探索在EGFR-TKI存在微环境中促使癌细胞发生EMT的因素可能会有助于揭示NSCLC发生EGFR-TKI获得性耐药机制。研究发现,EMT的启动受微环境中多种细胞外信号因子调控。肿瘤微环境是肿瘤细胞赖以生存的“土壤”,由炎细胞、细胞因子、细胞外基质等构成,其中在炎细胞中巨噬细胞（macrophages,MΦ）因其生理作用显得尤为突出。MΦ的基本生物学功能是参与炎症反应和免疫反应,清除坏死物及异物。当正常组织细胞受到毒性物质损伤发生坏死时,MΦ可能会浸入受损组织,在吞噬和清除坏死物质的同时通过分泌多种细胞因子保护受损细胞。文献报道,MΦ在多种肿瘤的生长、演进、侵袭和转移中也发挥重要促进作用,且MΦ在多种肿瘤中的浸润密度与患者预后呈负相关。许多研究通过体外构建构建小鼠肿瘤模型发现去除MΦ后肿瘤生长受到明显抑制,而这种抑制可随MΦ的注入而解除。这提示肿瘤细胞在变化着的微环境中的存活和增殖常需要MΦ辅助。肿瘤细胞虽然存在基因变异或蛋白表达异常,但其本质也是体细胞。当受到细胞毒性化疗药物作用时,很多肿瘤细胞因无法适应药物存在的新环境而死亡,那么肿瘤微环境中的MΦ会不会在吞噬和清除坏死组织细胞的同时,还分泌细胞因子保护剩余的存活肿瘤细胞,帮助它们从药物损伤中逃逸并转化为能够适应药物存在新环境且能在其中增殖的耐药细胞?与传统细胞毒性化疗药作用机理不同,EGFR-TKI并不直接杀伤细胞,而是抑制细胞增殖。这可能为MΦ帮助NSCLC细胞自身重塑,适应药物存在新环境提供机会。因而,我们推测在EGFR-TKI作用下肿瘤组织中MΦ作用不应该是杀伤肿瘤细胞,而应该是帮助肿瘤细胞适应药物存在的新环境,即帮助肿瘤细胞产生获得性耐药。多种肿瘤化疗药耐药的研究表明,MΦ能通过分泌某些细胞因子抑制肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞产生分解化疗药物酶等方式帮助肿瘤细胞适应药物存在新微环境并产生耐药,当MΦ被抑制后肿瘤的耐药性也会随之逆转。然而,有关MΦ能否促进NSCLC细胞产生EGFR-TKI获得性耐药的研究目前尚无报道,值得深入探讨。目的:本研究采用体外细胞共培养技术模拟体内肿瘤微环境,构建携带EGFR第20外显子T790M突变的人NSCLC细胞株NCI-H1975与MΦ体外可分离共培养体系,通过观察MΦ对gefitinib（EGFR-TKI代表药）作用下NSCLC细胞耐药性产生与EMT发生的影响,拟证明MΦ具有促进NSCLC细胞EGFR-TKI获得性耐药的作用,并初步探讨促进耐药发生的可能机制,希望本研究能为临床克服EGFR-TKI获得性耐药问题提供一点帮助。方法:（一）构建稳定的MΦ与NCI-H1975细胞可分离共培养体系1.NCI-H1975、THP-1及THP-1诱导出的MΦ细胞株的常规培养情况2.MΦ与NCI-H1975细胞体外可分离共培养体系的建立应用Transwell小室建立MΦ与NCI-H1975细胞体外可分离共培养体系。将MΦ接种于上层Transwell小室中,NCI-H1975细胞接种于下层六孔板中,实现两种细胞的可分离共培养。（1）共培养条件的确定:包括两种细胞在共培养体系中胎牛血清最适浓度、双抗（青霉素与链霉素）浓度、接种密度、细胞培养环境条件等。（2）MΦ与NCI-H1975细胞的共培养3.研究对象分组（1）NCI-H1975 组:NCI-H1975 单独培养（2）MΦ组:MΦ单独培养（3）NCI-H1975/MΦ组:MΦ与 NCI-H1975 共培养（二）Gefitinib浓度和作用时间的筛选1.Gefitinib浓度选择通过MTT 比色法测定gefitinib对NCI-H1975亲本株的半数抑制浓度（IC50）,从而选择药物作用浓度。2.Gefitinib作用时间的筛选（三）MΦ对NCI-H1975细胞在gefitinib微环境中保护作用的研究将 gefitinib（10μM、20μM 与 30μM）分别加入 NCI-H1975 组与 NCI-H1975/MΦ组,每个药物浓度均设3个复孔,并简写标记为NCI-H1975/10、NCI-H1975/20、NCI-H1975/30;NCI-H1975/MΦ/10、NCI-H1975/MΦ/20、NCI-H1975/MΦ/30。上述各组经gefitinib作用至已确定最适时间（48h）后,收集细胞,研究MΦ对NCI-H1975细胞在gefitinib耐药性、EMT发生情况及培养上清液中TGF-β1含量等方面产生的影响。1.Gefitinib 耐药性（1）肿瘤细胞生长状况（2）肿瘤活细胞密度（3）肿瘤细胞生长抑制曲线（4）肿瘤细胞gefitinib抑制率、IC50值和耐药指数2.EMT发生情况免疫细胞化学法和Western-blot法检测gefitinib作用后各组肿瘤细胞上皮标记蛋白E-cadherin和间叶标记蛋白Vimentin的表达情况并比较差异（1）免疫细胞化学法检测E-cadherin、Vimentin的表达（2）Western-Blot 法检测 E-cadherin、Vimentin 的表达3.培养上清液中TGF-β1含量ELISA法检测各组细胞在gefitinib作用下培养上清液中TGF-β1的含量并比较。结果:（一）建立了培养条件稳定的MΦ与NCI-H1975细胞可分离共培养体系1.NCI-H1975、THP-1与MΦ的常规培养情况三种细胞培养条件是:RPMI-1640完全培养基（含10%胎牛血清、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素）,37℃、5%CO2、饱和湿度、无菌。换液间隔时间48h。NCI-H1975细胞呈单层贴壁生长,长梭形;THP-1呈悬浮状态生长,圆形或椭圆形;MΦ呈贴壁生长,圆形或椭圆形,伸出伪足。2.经过二十余次试验摸索,建成培养条件稳定的MΦ与NCI-H1975细胞可分离共培养体系:（1）细胞培养液:含10%胎牛血清RPMI-1640完全培养基,双抗浓度:青霉素与链霉素均为100μg/ml。（2）细胞接种方式:NCI-H1975细胞接种于六孔板,最适密度为4×105/ml,传代时间72h;MΦ接种至Transwell小室,最适密度为2.5×105/ml,更新时间为96h;小室悬挂至六孔板培养,换液间隔时间为48h。（3）共培养环境条件:37℃、5%CO2及饱和湿度（4）共培养两种细胞形态:两种细胞生长状态良好,与常规培养无显著差别且未互相污染。（二）Gefitinib浓度和作用时间1.Gefitinib实验浓度MTT法测得gefitinib对NCI-H1975细胞的抑制率,绘制生长抑制率曲线。结果显示:Gefitinib对NCI-H1975细胞的抑制率随着药物浓度的升高逐渐增高,改良寇式法求得IC50值为14.61±0.03μM。选择三个gefitinib浓度（10μM、20μM、30μM）分别同时加入NCI-H1975组和 NCI-H1975/MΦ组。2.Gefitinib作用时间选择gefitinib作用各组肿瘤细胞时间为48h。（三）MΦ对NCI-H1975细胞在gefitinib微环境中保护作用的研究1.Gefitinib 耐药性（1）NCI-H1975/MΦ组肿瘤细胞的生长状况明显优于NCI-H1975组在三个浓度gefitinib下,NCI-H1975细胞在MΦ存在下的生长状况（活细胞形态和数量）均明显优于其单独培养条件,并且随着药物浓度的升高,两组肿瘤细胞生长状况的差异增大。（2）Gefitinib作用下NCI-H1975/MΦ组肿瘤活细胞密度高于NCI-H1975组NCI-H1975组与NCI-H1975/MΦ组肿瘤活细胞的密度在gefitinib浓度10μM时分别为（2.53±0.25）×105/ml 与（7.47±1.30）×105/ml（P<0.05）;浓度 20μM 时,分别为（1.63±0.107）×105/ml 与（5.28±0.13）×105/ml（P<0.05）;浓度 30μM 时,分别为（1.169±0.011）×104/ml与（4.81±0.045）× 105/ml（P<0.05）;这说明:在相同浓度gefitinib作用下,NCI-H1975/MΦ组肿瘤活细胞密度均显著高于NCI-H1975组。随着gefitinib浓度的增加,两组肿瘤活细胞密度的差异增大。（3）肿瘤细胞生长抑制曲线在相同浓度gefitinib作用下,NCI-H1975组与NCI-H1975/MΦ组肿瘤活细胞数均随着药物作用时间延长而减少,但NCI-H1975/MΦ组肿瘤活细胞数降低程度显著低于NCI-H1975组;这种差异随着gefitinib浓度的升高而增大。（4）肿瘤细胞的gefitinib抑制率、IC50值和耐药指数1)Gefitinib抑制率:在所有gefitinib浓度下,NCI-H1975/MΦ组肿瘤细胞的gefitinib抑制率均低于NCI-H1975组。2)IC50值:经测定,NCI-H1975/10与NCI-H1975/MΦ/10中的肿瘤细胞IC50值分别为 15.547±0.46μM 与 22.897±0.5μM（P<0.05）;NCI-H1975/20 与NCI-H1975/MΦ/20 中肿瘤细胞 IC50 值分别为 16.137±0.12μM 与 23.01±0.2μM（P<0.05）;NCI-H1975/30 与 NCI-H1975/MΦ/30 中的肿瘤细胞 IC50 值分别为16.71±0.8μM 与 23.19±0.019μM（P<0.05）。这说明在 gefitinib 各种浓度下,NCI-H1975/MΦ组肿瘤细胞IC50值均显著高于NCI-H1975组（P<0.05）。3)耐药指数:共培养组 NCI-H1975/MΦ/10、NCI-H1975/MΦ/20、NCI-H1975/MΦ/30对gefitinib的耐药指数分别为1.567、1.575和1.587。不同浓度的gefitinib下,耐药指数稳定。2.EMT发生情况（1）免疫细胞化学法检测两组肿瘤细胞E-cadherin和Vimentin蛋白表达情况浓度为10μM、20μM与30μM的gefitinib作用48h后,两组肿瘤细胞均有E-cadherin 和 Vimentin 蛋白表达。与 NCI-H1975 组相比,NCI-H1975/MΦ组肿瘤细胞E-cadherin表达强度明显减弱（P<0.05）,Vimentin蛋白的表达强度明显增强（P<0.05）。这说明在gefitinib药物环境中,NCI-H1975细胞在MΦ存在时更易发生EMT。（2）Western-bo1t法检测两组肿瘤细胞E-cadherin和Vimentin蛋白表达情况浓度为10μM、20μM与30μM的gefitinib作用48h后两组肿瘤细胞均有E-cadherin 和 Vimentin 蛋白表达。与 NCI-H1975 组相比,NCI-H1975/MΦ组的肿瘤细胞E-cadherin表达较弱,而Vimentin表达显著增强（P<0.05）。上述结果提示在gefitinib药物环境中,在MΦ存在下NCI-H1975细胞更易发生EMT。3.培养上清液中TGF-β1含量NCI-H1975 组、MΦ组和 NCI-H1975/MΦ组在 gefitinib 浓度 10μM 时上清液TGF-β1含量分别为0、0和（0.121±0.012）ng/ml（P<0.05）;浓度20μM时,分别为 0、0 和（0.122±0.008）ng/ml（P<0.05）;浓度 30μM 时,分别为 0、0 和（0.133±0.005）ng/ml（P<0.05）。这说明在gefitinib微环境中,与MΦ共培养的NCI-H1975培养上清液中TGF-β1含量显著升高。结论:1.建立了培养条件稳定的人NSCLCNCI-H1975细胞株与MΦ的可分离共培养体系。2.在体外培养中MΦ能使携带EGFR T790M突变的NSCLC细胞对EGFR-TKI的耐药性增强。3.EMT是携带EGFR T790M突变的NSCLC细胞产生EGFR-TKI获得性耐药的机制之一。4.在EGFR-TKI微环境中,MΦ能使与其共培养的NCI-H1975培养上清液中TGF-β1含量显著升高。