四倍体刺槐具有速生、抗旱、瘠薄和盐碱的特点,也是黄土高原地区防风固沙和水土保持的首选树种,但其为难生根树种,难于大面积推广。植物激素中的生长素可促进插穗的不定根形成。生长素吲哚丁酸(Indole-3-butyric acid,IBA)被广泛应用林木扦插繁殖不定根的诱导,更有效的促进不定根的形成。IBA可促进四倍体刺槐插穗生根。然而,IBA诱导不定根形成的分子机制仍不清楚。因此,进行四倍体刺槐插穗生根分子调控机制以及外源激素IBA对四倍体刺槐插穗生根的分子调控机制研究具有重要的理论和实践。本研究在前期利用双向电泳筛选的IBA诱导下插穗不同生根阶段的差异蛋白SAMS和MTN的基础上开展研究。以四倍体刺槐当年半木质化嫩枝插条为材料,首先通过同源克隆技术对SAMS和MTN基因进行了全长克隆、生物信息学分析、亚细胞定位;再利用定量PCR技术分析它们在不同生根阶段插穗基部的表达规律和不定根产生时期根、茎、叶和韧皮部组织中表达规律,同时分析了相应酶活性变化规律;并进一步分析与这两个基因所在MTA代谢循环中相关基因时空表达规律、相关酶活性和产物含量变化;然后,利用转基因技术,制备SAMS和MTN基因的转基因拟南芥,来研究这两个基因对拟南芥生根的生物学效应;最后,采用高通量测序技术分析IBA处理组和对照组硬枝插穗不定根发育过程中转录组的差异,并重点描述了插穗不定根发育过程中的转录组动态变化。本研究主要取得了以下结果:1、SAMS和MTN基因cDNA全长的克隆和亚细胞定位利用同源基因保守区设计简并引物,克隆SAMS和MTN基因,通过5’RACE和3’RACE技术获得c DNA全长。SAMS基因全长为1498 bp、开放阅读框为1179bp、编码392个氨基酸,与蓖麻、木豆、野生大豆、大豆等的同源性在94~96%;MTN基因全长为1158 bp、开放阅读框为810 bp、编码269个氨基酸,与鹰嘴豆、百脉根、羽扇豆、大豆的同源性在66~87%。通过亚细胞定位分析,SAMS和MTN蛋白主要定位于细胞膜和细胞质中,说明它们主要在细胞膜和细胞质行使其功能。2、SAMS和MTN基因的时空表达及他们的酶活性分析对IBA处理组不同时期表达谱分析发现:SAMS和MTN基因均在根原基形成时期表达量最高;在根原基形成和不定根产生时期,SAMS和MTN基因的表达量高于CK对照组。对IBA处理组不同部位组织的表达谱分析发现:SAMS和MTN基因均在插穗基部组织表达量最高,其次在叶、芽和根。SAMS和MTN酶活性分析发现:在根原基和不定根形成阶段IBA处理组高于CK对照组。IBA处理后促进了SAMS和MTN基因表达,从而提高了他们的酶活性。说明IBA可能通过诱导SAMS或MTN基因的表达来参与不定根形成的分子调控。3、转SAMS和MTN基因拟南芥生物学效应分析通过构建SAMS和MTN基因的过表达载体进行拟南芥转化,结果表明:转SAMS基因的T3代拟南芥植株相比野生对照组的不定根显著增长。因此,SAMS直接参与了不定根的发育调控。转MTN基因拟南芥植株的发育与野生型相比没有显著变化,说明MTN可能没参与不定根发育的调控。4、MTA代谢循环中关键基因及相应的酶活性分析分析MTA代谢循环中关键基因时空表达规律、关键酶的活性和产物含量变化结果表明:SAMDC、SPDS和MTK基因均在根原基形成时期表达量最高,且在根原基形成和不定根产生时期IBA处理组均高于CK对照组。ACS在不定根形成时期表达量最高,且在根原基形成和不定根产生时期ACS酶活性IBA处理组高于CK对照组。在根原基形成时期多胺和乙烯的含量最高,且在根原基形成和不定根产生时期IBA处理组多胺和乙烯的含量高于CK对照组。IBA处理组,不定根形成时期SAMDC、SPDS、ACS和MTK均在插穗基部组织表达量最高,其次在叶、芽和根。结果表明,IBA处理后MTA代谢循环中相关基因表达量显著升高,相关酶活性显著增加。其中,SAMS是MTA代谢循环中最关键的基因。表明SAMS基因是通过MTA代谢循环来参与不定根形成的分子调控。5、8个插穗基部组织denovo转录组测序与鉴定分析利用高通量测序技术分别对IBA处理组和CK对照组各4个生根阶段(起始期、愈伤组织诱导时期、根原基形成时期和不定根产生期)插穗基部组织进行denovo转录组测序。共获得64876258 clean reads,并被组装成59931个unigene,平均长度为732bp,其中38845个unigene被注释到50个GO功能类别中,17118个unigene分为25个COG功能类别中,以及17306条unigene归类到296个KEGG代谢途径中。在我们的转录组序列中发现了12281个SSRs和55800个SNPs。利用CPC软件预测共获得45923个lnc RNAs。首次揭示了四倍体刺槐IBA处理组和CK对照组4个不定根发育阶段的m RNA的种类、长度、表达特征和富集通路。6、转录组测序中差异基因筛选、表达谱及功能分析IBA处理的4个生根阶段转录组数据分析:总共检测到12261个基因至少在一个时期表达,其中4825个基因在4个时期都有表达。利用Cluster软件对8个转绿组数据进行聚类分析,所有的12321个基因被聚成40类。聚类分析的结果也显示在IBA处理组插穗里检测到86.7%的基因表达量在插穗生根过程发生了变化。比较IBA处理组CK组的基因表达模式发现两组中有30类表达模式是共同的。IBA处理组,起始期和愈伤组织期中共有8976个差异表达基因;愈伤组织期和根原基形成期中共有1677差异表达基因;根原基形成时期和不定根形成时期共有4383差异表达基因。且上调表达基因多于下调表达基因。IBA处理组与CK对照组相比,在起始期、愈伤组织形成时期、根原基形成时期和不定根产生期分别有2570、1685、1512和10558个基因差异表达(p<0.05和|log2fold-change|≥1)。表明m RNA在不同的生根阶段中有明显的时序性和动态变化。利用qPCR技术在IBA处理组和CK对照组的不同生根阶段对21个差异表达基因进行了验证,两者的相关系数为0.7056,表明获得的基因表达模式与高通量测序分析的结果基本一致。对IBA处理组不同生根阶段的差异基因进行GO和KEGG功能富集,结果明:显著差异基因主要富集到碳代谢和能量代谢,植物激素信号转导、细胞分化与增殖和细胞周期等通路上。还发现一些可能与四倍体刺槐扦插生根相关的基因(如SAMS、SAMDC、ACO、SPD、POD、ZFI、AIN和ARE等)。