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过氧化物酶（Peroxidase,POD）是一种以铁卟啉为辅基的金属酶,广泛分布于微生物、植物、动物中。过氧化物酶种类繁多,根据其所在位置将过氧化物酶分为动物来源、植物和微生物来源2个超家族。不同种类过氧化物酶在生物体内参与不同生化反应。目前对过氧化物酶的研究主要集中在植物体内作用和体外应用,体内作用涉及植物的生长发育、逆境胁迫、光合作用、呼吸作用以及酶促褐变等一系列方面。体外应用中过氧化物酶在污水处理、生物传感器制备、生命科学、医学临床检测、工业酿造方面作用突出。过氧化物酶是调控植物生成发育的关键性酶,它能以H2O2为电子供体催化酚类化合物转化为醌类化合物,醌类物质再通过聚合作用在甘薯表面形成棕色或黑色斑点。当植物受到机械损伤时,过氧化物酶与酚类物质接触导致植物出现褐变现象。褐变会影响甘薯营养价值、口感、外观以及造成资源浪费,而中国又是甘薯种植面积最大的国家,因此会严重阻碍甘薯产业发展。研究表明,目前关于酶促褐变研究大多集中在控制和防治两个方面,而酶促褐变发生和抑制分子机制尚不清楚,而且市面上一些抑制剂如曲酸、焦亚硫酸钠会对人体造健康危害。因此,发现,筛选无毒且高效的新型过氧化物酶抑制剂对抑制甘薯褐变,减少损失具有重要意义。采用抑制剂控制酶促褐变效果明显,因此受到普遍关注。本研究采用色谱、质谱技术成功分离纯化、鉴定了2种过氧化物酶同工酶,进行了简单生物信息学分析,并结合紫外可光光谱法、荧光光谱法、圆二色性（CD）和红外光谱法（FT-IR）、同源建模、分子对接等技术研究了人工合成抑制剂（抗坏血酸、焦亚硫酸钠、还原性谷胱甘肽）、天然抑制剂（木樨草素、植酸）对过氧化物酶同工酶的催化、抑制分子机理以及构效关系进行了分析。主要研究结果如下:（1）生物信息学分析发现甘薯中有23个过氧化物酶基因,共编码了23个过氧化物酶。序列比对发现甘薯peroxidase基因所编码蛋白质存在保守区域。进化树分析显示,发现甘薯和辣根、拟南芥、黄瓜亲缘关系较近。（2）通过色谱技术从‘忠薯1’中得到SPOD1和SPOD2两种同工酶。SPOD1比活力、纯化倍数、活性回收分别为1230527.7 U mg-1、171.74、8.38%;SPOD2比活力、纯化倍数、活性回收分别为813053.57 U mg-1、60.01、11.12%。SDS-PAGE显示SPOD1分子量分别为37.2 kDa,总分子量为37.0 kDa,SPOD2分子量分别为34.5 kDa,总分子量为35.1 kDa。Native-PAGE显示SPOD1和SPOD2在电荷和分子量上均存在差异,且均为单亚基蛋白质。（3）SPOD1和SPOD2最适pH为4.8和6.4,且均在pH 4～6范围内活性保持稳定。最适温度分别为65℃和45℃。SPOD1在25～55℃温度范围内活性保持稳定;SPOD2在25～65℃温度范围内活性保持稳定。Mg2+、Zn2+、Ba2+、Fe3+等金属离子是SPOD1和SPOD2激活剂,Mn2+、Cu2+在低浓度下表现出激活作用,高浓度表现出抑制作用。Ca2+对该同工酶活性无明显影响。抗坏血酸、SDS、草酸、KSCN等化合物强烈抑制SPOD1、SPOD2活性。EDTA作为螯合剂在低浓度条件下表现出激活作用,高浓度条件下表现出抑制作用。通过固定不同浓度的愈创木酚测得SPOD1,SPOD2的Km值分别为32.32 mmol L-1、19.75 mmol L-1。‘忠薯1’过氧化物酶同工酶的双底物酶促动力反应类型为乒乓反应。（4）通过nESI-LC-MS/MS鉴定得到SPOD1,SPOD2为数据库中对应代号为K9P1I1和Q5JBR5过氧化物酶,覆盖率分别达到24.69%,4.89%。SPOD1和SPOD2以过氧化物酶4USC、1QO4为模板得到较好模型。SPOD1中残基Ala191、Arg61与愈创木酚共轭,形成疏水相互作用。SPOD2中Pro163残基与愈创木酚形成氢键,Phe64与愈创木酚形成疏水相互作用。Ala191、Arg61、Pro163、Phe64是抑制酶促褐变关键氨基酸。氢键、疏水相互作用是过氧化物酶催化过程中重要驱动力。（5）抗坏血酸、焦亚硫酸钠、还原性谷胱甘肽对SPOD1和SPOD2均具有抑制作用。抗坏血酸属于竞争性抑制剂,半抑制浓度IC50分别为1.97×10-4、2.53×10-44 mol L-1,抑制常数Ki=4.95×10-5、5.0×10-5 mol L-1。焦亚硫酸钠属于非竞争性抑制剂,半抑制浓度IC50分别为3.52×10-4、3.11×10-4 mol L-1;抑制常数Kis=4.46×10-5、9.9×10-55 mol L-1。反竞争性抑制剂还原性谷胱甘肽半抑制浓度IC50分别为6.37×10-3、3.35×10-33 mol L-1;抑制常数Kis=5.37×10-4、99.01×10-44 mol L-1。抗坏血酸分别与SPOD1中Leu188、Ser189;SPOD2中Ala192氨基酸残基形成氢键。焦亚硫酸钠分别与SPOD1中His198氨基酸残基形成氢键,与Arg61形成疏水相互作用;与SPOD2中His65、Pro163氨基酸残基形成氢键,与Agr61形成静电相互作用。还原性谷胱甘肽分别与Val196、Arg61、Ser97、His198、Phe64;与SPOD2中Pro163、Arg197、Ser97、Arg61、Ile172、Ser269氨基酸残基形成氢键。（6）木樨草素、植酸是酶促褐变潜在抑制剂。非竞争性抑制剂木樨草素对SPOD1,SPOD2的IC50分别为9.98×10-5 mol L-1、10.02×10-5 mol L-1;竞争性抑制剂植酸对SPOD1,SPOD2的IC50为1.18×10-6 mol L-1、1.35×10-6 mol L-1。对过氧化物酶抑制能力排序:植酸>木樨草素。（7）木樨草素、植酸能淬灭SPOD1和SPOD2内源性荧光,且都属于静态淬灭机制。都能与SPOD1,SPOD2自发进行结合,且在酶表面只存在一个分子结合位点。结合距离r<8 nm而且0.5 R00,表明植酸、木樨草素与SPOD1和SPOD2作用均出现了非辐射能量转移现象。疏水作用力和氢键是植酸、木樨草素与SPOD1和SPOD2结合主要驱动力。植酸分别与SPOD1中Gly162、Arg167、Pro34、Asn72、Cys168;SPOD2中Asp245、Thr248、Asp250、Arg197、Pro249、Phe252、Ser190形成氢键。木樨草素与SPOD1中Pro132、Arg172、Pro132、Pro38形成氢键;Cys168、Pro38、Ala134与木樨草素苯环发生疏水相互作用。SPOD2中Arg197通过氢键与木樨草素连接;His193、Arg61、Ala192、Ile60、Phe64与木樨草素的苯环发生疏水相互作用。植酸、木樨草素能插入到SPOD1和SPOD2活性中心,与相应的氨基酸残基作用形成氢键和疏水相互作用,并阻碍了底物H2O2、愈创木酚进入催化活性中心,不利于底物与SPOD1和SPOD2结合,导致SPOD1、SPOD2催化效率下降。（8）木樨草素、植酸与SPOD1、SPOD2结合,使得色氨酸和酪氨酸荧光强度降低,同时色氨酸微环境发生变化。抑制剂与SPOD1、SPOD2相互作用使得二级结构中α-螺旋、无规则卷曲含量增加;β-折叠、β-转角含量降低直接影响了酶的活性和催化效率。