猪圆环病毒2型双亚型Cap蛋白在杆状病毒载体系统中的表达及其免疫原性

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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)是造成猪圆环病毒相关综合征的主要病原,可导致断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪呼吸道疾病综合征、猪皮炎肾病综合症和生殖系统疾病等,对养猪业造成了很大损失。  根据分子流行病学调查结果,PCV2可分为多种亚型,目前主要流行的是PCV2a及PCV2b两型。商品化的猪圆环病毒疫苗主要是基于PCV2a或者PCV2b亚型的全病毒灭活疫苗和基于PCV2a亚型的基因工程亚单位疫苗。由于PCV2在细胞中生长缓慢,全病毒疫苗制备工艺较传统,很难获得高滴度的病毒。因此,研制新型PCV2疫苗很有必要。  本研究利用pFastBac-Dual昆虫杆状病毒表达系统分别构建了可表达PCV2a和PCV2b及PCV2ab双亚型Cap蛋白的重组杆状病毒,并将各表达产物作为免疫原对小鼠进行免疫,比较并分析了各表达产物的免疫原性及保护力。  通过对PCV2a和PCV2b流行毒株进行PCR扩增,分别获得其orf2基因,并将其单独、顺次克隆入杆状病毒表达系统pFastBac-Dual质粒,分别获得三种重组质粒pFast-Cap:单亚型PCV2a的pFast-Capa、单亚型PCV2b的pFast-Capb和双亚型PCV2ab的pFast-Capab。将这三种重组质粒分别转化E.coli DH10Bac感受态细胞,分别获得三种重组杆状病毒质粒,再以脂质体法转染昆虫细胞Sf9,通过在Sf9细胞上连续繁殖获得了三株重组杆状病毒PCV2a-Cap、PCV2b-Cap和PCV2ab-Cap,并将这三株重组杆状病毒分别感染Sf9细胞,获得了三种Cap蛋白(Capa,Capb and Capab)。通过对表达的三种Cap蛋白大小的SDS-PAGE和Western blot鉴定,以及ELISA检测,结果表明三种Cap蛋白均成功表达,并获得较高的蛋白表达量。  将获得的三种Cap蛋白分别于弗氏佐剂混合制备成疫苗,分别经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA方法检测,结果显示,小鼠在免疫后14天,血清中即产生PCV2特异性抗体,且免疫后21天、28天抗体呈上升趋势;在免疫后28天,用PCV2a和PCV2b强毒株分别攻击小鼠,攻毒后28天,通过荧光定量PCR方法检测小鼠脾脏组织PCV2病毒拷贝数,结果显示,各免疫组病毒拷贝数显著低于未免疫对照组,而免疫双亚型Capab组的PCV2病毒拷贝数显著低于免疫Capa或Capb单亚型组。  综上所述,本研究成功获得了重组杆状病毒表达的PCV2a和PCV2b及PCV2ab双亚型Cap蛋白,并经过小鼠的免疫保护试验初步证明PCV2ab双亚型Cap蛋白产生的保护性更高,为开发有效防控猪圆环病毒的新型疫苗提供了基础。
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