脂肪基质细胞源性神经元突触释放功能的相关分子结构研究

来源 :华北理工大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:tsinfang
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目的:探究经β-琉基乙醇(β-Mercatoethanol,βME)诱导的脂肪基质细胞(Adipose-derived stromal cells,ADSC)源性神经元是否具备正常成熟神经元突触释放功能相关的分子基础及结构基础。  方法:1体外提取ADSC并进行培养、传代。2利用βME诱导ADSC向神经元进行分化。3ADSC源性神经元的鉴定:免疫细胞化学法和Western-blotting法检测ADSC组、诱导1h、3h、5h、8h组细胞神经元特异性烯醇化酶(Neurons specific enolase,NSE)和神经元特异性的微管相关蛋白2(Microtubule associated protein2,MAP2)的表达情况。4应用免疫细胞化学法、免疫荧光双标法和Western blotting法检测各组细胞中神经元突触释放功能的核心分子突触蛋白Ⅰ(SynapsinⅠ)、突触囊泡蛋白2(Vesicle-associated membrane protein2,VAMP2)、突触融合蛋白(Syntaxin1A)、突触小体相关蛋白(SNAP-25)和突触结合蛋白1(Synaptotagmin1)的表达情况及规律。5应用透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)观察诱导5h时ADSC源性神经元的超微结构特征。6统计学分析所取得的实验数据均采用SPSS17.0软件包进行统计分析,用单因素方差分析进行F检验,以P<0.05为差异有统计学意义。  结果:1初提取的ADSC在24h内贴壁,细胞形态多样,以圆形为主。随着培养时间的延长,ADSC逐渐成为长梭形,呈旋涡状生长排列。第三代ADSC纯化完全,生长旺盛适于诱导分化。2正式诱导分化1h时,可见细胞胞质回缩、突起变长。3h时,ADSC源性神经元突起继续增长,且有细胞伸出多条突起出现多极神经元样细胞形态。5h时,ADSC源性神经元轴突样突起的末端出现树突样细小分支,且突起之间相互连接形成网状结构。ADSC源性神经元以双极神经元样为主,且多极神经元数量进一步增多,呈现出典型的成熟神经元样形态。8h时,细胞树突样结构和长突起的数量均少于5h组,ADSC源性神经元形态学上出现退化。3ADSC源性神经元的鉴定:ADSC组不表达NSE和MAP2,在各诱导组均可见NSE阳性细胞和MAP2阳性细胞。在本实验所观察时间点中,NSE和MAP2表达率均于诱导5h时达到高峰,诱导8h组与5h组无统计学差异(P均>0.05)。4免疫细胞化学法和Western-blotting法检测发现ADSC组不表达Synapsin I、VAMP2、Syntaxin1A、SNAP-25及Synaptotagmin1,各诱导组均检测到上因子的表达。随着诱导时间的延长,SynapsinⅠ、Syntaxin1A的阳性率及表达水平逐渐升高,诱导8h组高于其他各组,且各时间点间差异有统计学意义(P均<0.05)。在本实验所观察时间点中,VAMP2、SNAP-25、Synaptotagmin1的阳性率及表达水平均于5h时达到高峰,其中VAMP2、SNAP-25的阳性率及表达水平8h组与5h组无统计学差异(P均>0.05);Synaptotagmin1的阳性率及表达水平8h组较5h组有所下降(P<0.05)。5免疫荧光双标法检测发现ADSC组未见NSE/SynapsinⅠ、NSE/VAMP2、NSE/Syntaxin1A、NSE/SNAP-25、NSE/Synaptotagmin1共表达细胞,各诱导组均可见上述因子共表达细胞。在本实验所观察时间点中,NSE/Synapsin I、NSE/Syntaxin1A的共表达率于诱导8h组高于其他各组,且各时间点间差异有统计学意义(P均<0.05)。NSE/VAMP2、NSE/SNAP-25、NSE/Synaptotagmin1共表达率于诱导5h组达到高峰,其中NSE/VAMP2、NSE/SNAP-25的共表达率8h组与5h组无统计学差异(P均>0.05);NSE/Synaptotagmin1的共表达率8h组较5h有所下降(P<0.05)。6透射电镜下观察诱导5h的ADSC源性神经元,可见细胞表面存在较多的微绒毛和突起,细胞器含量丰富,可见到尼氏体样结构。ADSC源性神经元的胞质中尤其是细胞膜附近可见到大量圆形囊泡,密度不等,有些囊泡电子密度较低,含量较丰富,类似于神经元突触中的清亮小囊泡,有些囊泡电子密度较高,体积较大,数量较少,类似于神经元突触中的致密核心大囊泡,并且有些囊泡的囊泡膜与细胞膜部分融合,类似处于囊泡释放状态。  结论:ADSC源性神经元具有典型神经元突触囊泡样结构和突触囊泡释放功能所需的SynapsinⅠ、VAMP2、Syntaxin1A、SNAP-25及Synaptotagmin1,ADSC源性神经元具有正常神经元的突触囊泡动员、激活及膜融合功能。
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