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目的：目前广泛用于乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)核酸检测的质控品和标准品多为质粒DNA或阳性患者血清。它们具有易被脱氧核糖核酸酶(deoxyribonulcease，DNase)降解、具有生物危害传染性、稳定性较差和异质性等缺点。本研究应用传统的lambda噬菌体克隆程序，表达一种耐DNase的内嵌HBVDNA片段的嵌合型lambda噬菌体，作为HBV核酸检测的新型质控品和标准品。
方法：首先通过重叠PCR延伸HBV的“C蛋白”和“S蛋白”编码基因序列，使其成为DNA嵌合体，在其正义引物和反义引物中分别引入EcoRI酶切位点，并与pGEM-T Easy载体相连，形成重组质粒。然后用EcoRI限制性内切酶将DNA嵌合体从重组质粒中切下，插入到lambda gtll噬菌体基因组中的EcoRI克隆位点后，进行噬菌体的体外包装和铺板过程，得到独立的噬菌体克隆。应用噬菌体特异引物进行PCR扩增，从而鉴定出内嵌靶HBVDNA片段的嵌合型lambda噬菌体。最后应用丙烯葡聚糖凝胶层析纯化得到的嵌合型lambda噬菌体，并对其耐酶性及存在于SM培养基和正常人血清中的稳定性进行初步研究。
结果：成功构建了内嵌HBVDNA片段的嵌合型lambda噬菌体。DNase和RNase消化结果表明，此嵌合型lambda噬菌体具有很好的耐DNase和RNase的特性。另外，此嵌合型lambda噬菌体在SM培养基中于4℃条件下可稳定存在至少三个月，室温和37℃条件下能稳定存在2周；在正常人血清中于4℃和室温条件下能稳定存在3天，37℃条件下能稳定存在1天。
结论：应用传统的lambda噬菌体克隆程序，成功表达了内嵌HBVDNA片段的耐DNase的嵌合型lambda噬菌体，其在SM培养基中具有很好的稳定性、对人无生物危害传染性、制备简单、可监控核酸检测全程，因而可作为质控品和标准品用于临床HBV核酸检测。另外，应用此方法也可将其他较长靶DNA片段包入lambda噬菌体内，解决同一个临床标本进行多个病毒的同时检测、无国际标准品DNA病毒检测的溯源等问题。
目的：本研究拟通过改变大肠杆菌噬菌体MS2包装位点(pacsite)的数量、亲和力和位置，应用单质粒双表达系统表达内含长片段HIV—1 RNA片段的耐核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)的病毒样颗粒，从而用做HIV—1 RNA bDNA检测的质控品和标准品，并进一步系统探讨包装位点在表达内含长片段RNA的病毒样颗粒中所起的作用。
方法：
1.单质粒双表达重组载体的构建：首先PCR扩增MS2噬菌体基因组中编码成熟酶蛋白和衣壳蛋白的基因序列(nt81～1，746)，插入单质粒双表达载体pACYCDuet—1的第一个酶切位点，得到重组载体pACYCDuet—1—MC。然后应用重叠PCR将不同数量、亲和力的MS2包装位点插入到HIVpol编码序列中的不同位置，从而得到10个含有不同数量、亲和力的MS2包装位点的嵌合HIV pol序列。最后，将这10个嵌合HIV pol长片段分别与重组表达载体pACYCDuet—1—MC相连接，得到10个不同的单质粒双表达重组载体。
2.VLPs的表达：将10个不同的单质粒双表达重组载体分别转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，然后将阳性克隆菌接种于氯霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养2.5hr，加入异丙基硫代-β—D半乳糖苷至终浓度1mM进行诱导表达，超声碎菌后离心，收集上清，得到表达产物VLPs。
3.VLPs的纯化：在上清中加入DNaseⅠ和RNaseA，37℃过夜消化，然后分子筛色谱层析纯化VLPs。
4.VLPs的验证：对上述纯化后的VLPs做RT-PCR，以验证VLPs是否包装了全长的嵌合RNA片段。
5.耐核糖核酸酶HIVbDNA检测质控物和标准品的临床验证试验：稳定性实验、耐酶性实验、作为质控品的验证实验、线性实验、作为标准物品的验证实验。
结果：成功构建了10个单质粒双表达重组载体，含2个或3个包装位点突变体(C—variant pac site)的单质粒双表达重组载体表达的VLPs均包装了全长的目的序列，无论C—variant pac site在外源RNA序列中的位置如何，而其他单质粒双表达载体表达的VLPs均未能包装全长的目的序列。带有3个C—variant pac site的单质粒双表达重组载体表达得到的VLPs(VLP—C-PacⅢ)具有最高的表达效率。VLP—C-PacⅢ作为HIV—1RNA bDNA检测的质控品和标准品，完全耐DNase和RNase，并具有很好的HIV—1 RNA bDNA临床验证结果。
结论：病毒样颗粒的包装能力和表达效率随着包装位点数量和亲和力的增加而增加，而与包装位点在外源RNA分子中的位置无关；成功制备了可用于HIV—1RNAbDNA检测的耐核糖核酸酶的armoredRNA质控品和标准品。