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植物Na+,K+/H+反向交换体(NHX)在维持细胞内离子平衡、调节p H以及植物生长发育及逆境应答等过程中起着重要的作用。拟南芥At NHX5和At NHX6定位于Golgi、TGN(trans Golgi network)和PVC(prevacuolear compartment)上。研究发现,nhx5 nhx6双突变体植株矮小、角果短、结实率低,表明At NHX5和At NHX6调节着植物的生长发育。但是,At NHX5和At NHX6调节植物生长发育的分子机理目前尚不清楚。生长素在花粉生长发育过程中起着重要的作用。研究发现,拟南芥生长素转运蛋白At PIN8特异的表达在花粉之中,具有调节花粉生长发育的功能。我们采用分子遗传学方法,观察了nhx5 nhx6双突变体、nhx5 nhx6 pin8三突变体以及At PIN8过表达植株花粉萌发和花粉管生长过程。同时,我们观察了nhx5nhx6双突变体和nhx5 nhx6 pin8三突变体的花粉传粉和花粉形态。我们的目的是阐明At NHX5和At NHX6调节花粉生长发育的分子机理。本研究取得的结果如下:1.花粉体外萌发和生长实验发现,nhx5 nhx6的花粉萌发和花粉管生长受阻。15m M KCl处理下,Col-0的花粉萌发率和花粉管生长分别下降了30%和50%,nhx5 nhx6分别下降了25%和38%;20 m M Na Cl处理下,Col-0的花粉萌发率和花粉管生长分别下降了42%和45%,nhx5 nhx6分别下降了28%和38%;在酸性p H(4.5)和碱性p H(7.5)中,Col-0的花粉管生长分别增加24%和下降23%,nhx5 nhx6花粉管生长在酸性和碱性p H都没有发生任何显著性变化,表明At NHX5和At NHX6具有调节花粉生长发育的功能,它们在花粉响应离子和p H变化过程中起着重要的作用。2.通过杂交获得nhx5 nhx6 pin8三突变体和nhx5 pin8与nhx6 pin8双突变体。在100 m M NAA处理下,Col-0花粉萌发率下降18%,pin8-1,nhx5 nhx6,nhx5pin8,nhx6 pin8,nhx5 nhx6 pin8花粉萌发率下降的幅度相似,分别为25%,21%,23%,20%,23%;同样,Col-0花粉管生长下降20%,pin8-1,nhx5 nhx6,nhx5 pin8,nhx6 pin8,nhx5 nhx6 pin8花粉管生长下降的幅度相似,分别为29%,28%,29%,24%,30%,表明At NHX5和At NHX6与At PIN8没有叠加作用,进一步证明At NHX5和At NHX6可能是通过调节At PIN8而起作用。3.采用花粉特异启动子LAT52,制备PIN8过表达植株。将LAT52::PIN8过表达在Col-0后,没有NAA处理下,花粉萌发没有发生变化,但是,花粉管生长增加10%;在100 m M NAA处理下,花粉萌发率和花粉管生长分别增加了18%和19%。然而,LAT52::PIN8过表达在nhx5 nhx6后,无论有无NAA处理,花粉萌发和花粉管生长没有发生显著变化,表明At PIN8的功能可能依赖于At NHX5和At NHX6的活力。4.采用35S启动子制备过表达植株,观察植物生长发育。发现35S::PIN8(Col-0)过表达植株幼苗下胚轴和根显著增长,抽薹开花提前;然而,35S::PIN8/NHX5(Col-0)与35S::PIN8/NHX6(Col-0)的下胚轴,根生长以及抽薹开花都与Col-0一样,表明At NHX5和At NH6调节着At PIN8的功能。5.激光共聚焦显微镜观察发现,At NHX5和At NH6与At PIN8存在共定位,暗示了二者之间可能存在相互作用。6.采用DR5检测花序生长素的分布,发现Col-0和nhx5,nhx6的花药中有较高水平的生长素,然而,nhx5 nhx6花药中生长素的分布极为低下。7.花粉传粉实验发现,Col-0和nhx5 nhx6的传粉率相似,分别是51%和50%,而pin8-1和nhx5 nhx6 pin8的传粉率较低,分别是38%和37%;DAPI染色实验发现,pin8-1,nhx5 pin8,nhx6 pin8和nhx5 nhx6 pin8花粉营养细胞和精细胞的数目及排列分布正常的花粉数目相似,且都显著低于Col-0和nhx5 nhx6,表明At NHX5和At NHX6不影响花粉传粉和花粉形态。总之,我们的研究发现,At NHX5和At NHX6具有调节花粉生长发育的作用。At NHX5和At NHX6可能通过调节At PIN8的活力和细胞生长素的水平而调节花粉的生长发育过程。