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目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常见、最严重的并发症之一。近年来,随着生活水平的提高,生活方式的改变,DN的发病率呈逐年上升趋势,其逐渐成为导致终末期肾衰竭(end-stage renal failure,ESRF)的首位或主要病因,给家庭和社会带来沉重的经济负担。DN的主要病理学表现为肾脏体积增大,肾小球基底膜增厚,系膜细胞增生、肥大及系膜区细胞外基质(extracellular matrix,ECM)进行性积聚,并逐步发展为肾小球硬化。系膜细胞是肾小球固有细胞的一种,在维持肾小球的正常结构和功能方面发挥着重要作用,同时不可避免的参与了DN的发病过程。Megsin是一种系膜细胞优势表达基因,定位于染色体18 q21.3,同源性分析显示该基因属于seprin超家族一员。Serpin功能广泛、成员众多,主要参与血液凝固、纤维蛋白溶解、补体激活、炎症反应、及组织重建等过程,对细胞增生、凋亡、信号转导、细胞外基质代谢等发挥重要影响。Megsin作为serpin的成员之一,势必参与系膜细胞的某些生理、病理活动,因此探讨megsin在肾小球系膜细胞中的作用对于深入揭示DN的发生机制具有重要意义。DN的发生、发展是多种因素综合作用的结果,如生化代谢紊乱、肾小球血流动力学异常、细胞因子异常分泌、氧化应激等,其中PDGF、TGF-β是两类对系膜细胞增殖和ECM积聚具有重要影响的细胞因子。研究表明,高糖环境下,肾小球系膜细胞中转化生长因子β1(transforming growthfactor-β1,TGF-β1)、血小板源性生长因子-BB(platelet derived growth factor-BB , PDGF-BB)的mRNA表达均增高, ERK(extracellular signal-regulated protein kinase )信号转导通路被激活。PDGF-BB可能通过ERK通路作用于系膜细胞,上调TGF-β1mRNA的表达,促进ECM如纤维连接蛋白(FN)的合成,抑制ECM的降解,参与肾小球硬化的过程。ERK是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族主要成员,是胞内介导胞外刺激的重要信号系统之一,其包括两个高度同源的亚类ERK1/ERK2,通过磷酸化修饰而被激活。激活的ERK将外界信号传导到细胞核内,参与细胞生长、发育、分裂、死亡等多种生理反应的过程。另有研究发现,大鼠系膜细胞转染megsin基因后,可见PDGF-BBmRNA的表达,其TGF-β1mRNA的表达也显著上调,两者与转染megsin基因呈时间依赖关系。也就是说大鼠系膜细胞转染megsin基因后,可刺激细胞PDGF-BB、TGF-β1的分泌,从而推测在DN发生、发展过程中,megsin与PDGF-BB、TGF-β1之间势必存在着密切联系,但megsin与ERK之间是否存在联系目前尚未知晓。本研究拟通过体外培养肾小球系膜细胞,对系膜细胞megsin基因的表达进行干预,探讨高糖环境中过表达megsin基因的小鼠肾小球系膜细胞合成ECM的变化,以及经高糖刺激后过表达megsin基因的肾小球系膜细胞可能的信号传导途径。进一步研究在高糖环境中,megsin基因是否会通过PDGF-BB影响ERK通路从而促进系膜细胞增生和ECM积聚,希望能够进一步揭示DN的发病机制,为DN的防治提供新的理论依据。方法:将培养的小鼠肾小球系膜细胞分为六组:即正常对照组(A组,D-葡萄糖5.5mmol/L)、高糖组(B组,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+空质粒组(C组,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+megsin质粒组(D组,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+megsin质粒+ERK通路抑制剂组(E组,D-葡萄糖30mmol/L)、高糖+siRNA组(F组,D-葡萄糖30mmol/L)。大量提取已构建的megsin表达质粒、空质粒和megsin siRNA表达质粒,按实验分组设计应用脂质体2000瞬时转染相应质粒(western blot法测定各组细胞megsin蛋白表达量以检测转染效率)并给予相应刺激,分别在培养12、24、48小时后,采用免疫细胞化学和western blot方法测定各组系膜细胞megsin、PDGF-BB、磷酸化的ERK1/2(pERK1/2)、TGF-β1及FN的表达,RIA法测定各组细胞上清液中IV型胶原浓度(结果用总蛋白校正)。结果:免疫细胞化学结果显示:在正常糖环境下,pERK1/2存在于系膜细胞的胞浆中,呈浅棕黄色,表达较弱;高糖刺激12h后可见pERK1/2由胞浆向胞核转移,且随时间延长,胞核中表达逐渐增强,呈深棕黄色强表达,且胞浆中表达也明显高于正常组(P<0.05);高糖环境下,系膜细胞转染megsin基因后此种趋势更显著。应用ERK通路抑制剂后,pERK1/2于胞浆、胞核中的表达均被明显抑制。从12h开始,B组较A组小鼠系膜细胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1和FN蛋白水平开始升高,48h达到高峰(P<0.05);C组和B组同期相比差异无显著性(P>0.05); D组与B组同期相比,megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1和FN蛋白水平升高,差异有显著性意义(P<0.05);E组与D组同期相比, megsin和PDGF-BB的表达无明显变化(P>0.05),pERK1/2、TGF-β1和FN蛋白水平下降,差异有显著性意义(P<0.05);F组与B组同期相比,megsin、PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1和FN蛋白水平降低,差异有显著性意义(P<0.05)。Western blot结果显示:从12h开始,B组较A组小鼠系膜细胞megsin、PDGF-BB、pERK1/2和TGF-β1蛋白水平开始升高,48h达到高峰(P<0.05);C组和B组同期相比差异无显著性(P>0.05); D组与B组同期相比,megsin、PDGF-BB、pERK1/2和TGF-β1蛋白水平升高,差异有显著性意义(P<0.05);E组与D组同期相比, megsin和PDGF-BB的表达无明显变化(P>0.05),pERK1/2和TGF-β1蛋白水平下降,差异有显著性意义(P<0.05);F组与B组同期相比,megsin、PDGF-BB、pERK1/2和TGF-β1蛋白水平降低,差异有显著性意义(P<0.05)。放射免疫测定显示:从12h开始,B组小鼠系膜细胞上清液中IV型胶原浓度(细胞总蛋白浓度校正)较A组开始升高,48h达到高峰(P<0.05);C组与B组同期相比差异无显著性(P>0.05);D组与B组同期相比,系膜细胞上清液中IV型胶原浓度升高,差异有显著性意义(P<0.05);E组与D组同期相比,系膜细胞上清液中IV型胶原浓度降低,差异有显著性意义(P<0.05)。F组与B组同期相比,系膜细胞上清液中IV型胶原浓度降低,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:体外实验证实,高糖环境下小鼠系膜细胞ERK通路活化,megsin、PDGF-BB、TGF-β1、IV型胶原及FN的表达增加。高糖环境下过表达megsin基因可进一步上调系膜细PDGF-BB、pERK1/2、TGF-β1、IV型胶原及FN的表达。在此基础上应用ERK通路抑制剂后,能明显抑制系膜细胞pERK1/2、TGF-β1、IV型胶原及FN的表达,但对系膜megsin和PDGF-BB的表达无抑制作用。高糖环境下,对megsin基因进行干扰后,上述因子表达下调,提示高糖环境下,转染megsin基因的系膜细胞PDGF-BB也可能部分通过ERK通路引起TGF-β1升高及ECM合成增加。