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阿片肽(Opioid Peptide)是一种神经免疫肽,有激素和神经递质的功能,对中枢神经系统及外周器官均起作用,分为内源性阿片肽和外源性阿片肽。从已经发现的外源阿片肽数量来看,很大一部分都来自酪蛋白,这些肽均以无活性的状态存在其中,只有用适当蛋白酶水解才能从酪蛋白前体物中释放出来,因此,在体外条件下,只要调节适当的pH值、温度和水解时间,用适当的蛋白酶或不同蛋白酶的组合进行水解,就可以获得一定量的阿片肽。本研究利用不同蛋白酶酶解酪蛋白,确立了生成最高阿片活性的酶解条件;并对酶解液进行了醇沉粗提和Sephadex层析,从而分离得到了一种具有阿片活性的短肽;经氨基酸组成分析及与酪蛋白的氨基酸序列比较获知,该肽是一种新型阿片肽,并根据其序列推测了它的空间结构;通过离体豚鼠回肠和小鼠负重游泳试验分别测定了该肽抑制回肠收缩和抗疲劳的功能。试验结果表明:相比胰蛋白酶和木瓜蛋白酶,胃蛋白酶酶解酪蛋白能产生更高的阿片活性,其优化条件为:底物浓度3%(w/v),酶解时间2.5h,酶与底物的比例30000u/g,pH=2.0,酶解温度42℃;之后,经80%乙醇沉淀杂蛋白,阿片活性物质基本保留在上清液中;通过SephadexG-50层析,收集活性峰即第三个峰再经SephadexG-15细分离,经检测第四个峰具有活性; Tricine-SDS-PAGE电泳和毛细管电泳检测,该峰是一种单一组分,对其进行氨基酸组成分析和适合度检验得知,其对应于Alpha-S1-casein的144-158序列YFYPE LFRQFYQLDA,分子量为2252.48。在国际权威蛋白及生物活性肽数据库查询得知,这是一种新型的阿片活性肽。利用蛋白分析序列软件ANTHEPROT 5.0和The Swiss- Pdb Viewer对其性质和结构进行了相应预测,其等电点pI=4.035,二级结构中螺旋占40%,盘绕占27%,转角占20%,折叠占13%,第四位PRO处有一个折叠,且结构中有四个电荷集中区域。最后经离体豚鼠回肠实验发现,该肽可以抑制回肠的自主收缩,绘制量效曲线得出它的半数抑制浓度为IC50=3.177mg/ml,小鼠负重游泳试验也证明该肽确有明显的抗疲劳作用。