呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿下呼吸道疾病最重要的病原,可导致包括肺炎和支气管炎在内的严重的呼吸道疾病。在全球,每年会造成6,400万例感染病例和16万例死亡病例。由于RSV致病机理不清,目前对于RSV感染尚无有效的疫苗或特异性抗病毒药物,因此迫切需要对其致病机理进行深入研究。研究表明,免疫调控在RSV致病中具有重要的作用,主要表现为CD4+T细胞的免疫反应失衡,但其具体机理尚不清楚。单核细胞是机体防御系统的重要组成部分,在机体损伤治愈、抗御病毒入侵和对疾病的免疫方面起着重要的作用。但是单核细胞在RSV致病机理中的作用并不清楚,特别是其与RSV感染导致的机体CD4+T细胞免疫反应紊乱的关系尚未有文献报道。为观察RSV能否通过感染单核细胞调控CD4+ T细胞亚群的增殖,我们用RSV感染单核细胞,感染后的单核细胞与CD4+T细胞共培养7天后,收获细胞检测增殖的CD4+T细胞中Th1、Th2、Th17和Treg亚群的比例。实验结果显示,RSV感染的单核细胞可降低Treg的比例,增加Th2的比例,但对Th1和Th17的比例无显著影响。研究结果提示,RSV感染的单核细胞可以调控CD4+T细胞亚群的增殖。单核细胞可以分为CD16+和CD16-两个亚群,为阐明介导RSV调控作用的具体单核细胞亚群,我们通过流式细胞分选仪将单核细胞分选为CD16+和CD16-两个亚群。采用相同滴度的RSV分别感染CD16+和CD16-单核细胞,结果显示RSV感染CD16+单核细胞的效率更高。将RSV感染的CD16+和CD16-单核细胞分别与CD4+T细胞共培养一周后,检测RSV感染的两种单核细胞亚群对CD4+T细胞亚群增殖的影响。结果显示RSV感染的CD16+单核细胞可以显著降低Treg细胞比例,同时增加Th2细胞比例。而RSV感染的CD16-单核细胞无明显调控作用。该结果表明RSV可通过感染CD16+单核细胞调控CD4+T细胞亚群的增殖。为初步研究RSV感染后CD16+单核细胞调控CD4+ T细胞亚群增殖的机理,我们将RSV感染的CD16+单核细胞与CD4+T细胞共孵育,同时在培养基中加入多种细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13、IL-27和TNF-α)的中和抗体及其对照抗体,来观察CD4+T细胞中Treg以及Th2的比例变化。实验结果显示,中和IL-10后,RSV感染的CD16+单核细胞对Treg的抑制作用减弱,同时我们检测了单核细胞和CD4+T细胞共培养体系上清中多种细胞因子的浓度,结果显示在加有RSV感染的CD16+单核细胞的实验组中,IL-10的水平显著上升,提示IL-10可能介导了 RSV对Treg的抑制作用;中和IL-1β和TNF-α后,RSV感染的CD16+单核细胞对Th2的促进作用减弱,提示IL-1β和TNF-α可能介导了RSV对Th2的促进作用。为了进一步研究RSV病毒蛋白在上述免疫调控中的作用,我们设计了一条创新性的技术路线快速构建了多种可诱导性表达RSV蛋白的细胞系。将不同的RSV病毒蛋白基因分别克隆到含有PiggyBac转座子位点的Cumate诱导表达载体上,与PiggyBac转座酶质粒共转染HEK293细胞,利用嘌呤霉素进行筛选,并用Cumate诱导病毒蛋白表达。流式细胞仪及Western blot检测结果均表明,加入诱导剂Cumate后,筛选的细胞系中开始表达相应的病毒蛋白,提示细胞系构建成功。从而证明了利用PiggyBac转座子可以高效率的构建诱导性表达RSV病毒蛋白的细胞系。该项工作为研究RSV病毒蛋白在上述免疫调控中的作用打下了基础。综上所述,我们发现RSV能够通过感染CD16+单核细胞调控CD4+ T细胞亚群的增殖,其中对Treg的调控作用可能是通过IL-10来介导的,对Th2的调控作用可能是通过IL-1β和TNF-α来介导的;在后续研究中,我们将进一步探索并定位介导上述免疫调控作用的具体RSV病毒蛋白。本研究发现了一条崭新的RSV调控机体免疫反应的通路,为深入阐明RSV的致病机制提供了新的信息,并为治疗RSV相关疾病提供了潜在靶标。