论文部分内容阅读
扬子鳄(Alligator sinensis)是我国特有的珍稀濒危野生动物,长期以来,由于人类的捕杀和栖息地的丧失,其野外种群的数量已不足120条。为了保护这一珍稀濒危物种的基因资源,本论文以长兴扬子鳄自然繁育研究中心提供的血液样品为材料,以细菌人工染色体(BAC)为载体,建立了高容量的扬子鳄基因组BAC文库。同时在基因组BAC文库的基础上,利用PCR和DNA Walking步移法等技术,构建了扬子鳄MHC I类基因组的克隆重叠群,从而为后续开展MHC基因组的物理图谱构建,以及MHC的基因组计划等工作,提供了关键的材料平台。主要研究结果如下：
1.以新鲜血液为材料,利用pCC1BAC载体,成功构建了扬子鳄的基因组细菌人工染色体(BAC)文库。文库包含的164,352个BAC克隆,保存于1,712块96孔培养板上。经对随机挑取的150个BAC克隆进行脉冲电泳检测,计算出文库的平均插入片段为90kb,覆盖扬子鳄基因组约5.2倍(除去5.33％的空载体)。同时,从文库中获得任一单拷贝或多拷贝扬子鳄基因的概率为99.63％。
2.用9对PCR引物筛BAC文库分别可以得到2-9个阳性克隆,平均每对能够在文库中成功扩增到4.78个阳性克隆,证实了所建文库具有较高的覆盖率。
3.运用4D-PCR文库筛选技术,建立了扬子鳄基因组BAC文库的高效PCR筛选文库。该文库包括35个超级库和1190(35×34)个1D、2D、3D、4D超级亚库。任一引物或探针只需69个PCR反应,即可从BAC文库中筛选到所需的阳性BAC克隆。
4.通过综合分析GeneBank数据库同源序列的特点,设计了筛库的兼并引物,通过优化引物最终得到了15个初筛阳性克隆,并利用DNA Walking步移法得到了3个初筛阳性克隆的侧翼序列,设计了3对MHC Ⅰ类基因的特异基因引物,对初筛克隆进行了进一步的确认,最终得到了4组BAC克隆重叠群：①.66B3、593C8和1542A12;②.298D4、423C6、453D5、500H12、1322A8和1715F3;③.678A8和751E7;④.20A2、202C7、28082和941A9。