论文部分内容阅读
组织工程研究主要包括四个方面：种子细胞；组织工程支架材料；构建组织器官的方法和技术以及组织工程的临床应用。其核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，最大优点是可形成具有生命力的活体组织，对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。理想的组织工程支架材料通常应具备以下特点：良好的表面相容性与生物相容性，适度的生物降解速率，良好的结构相容性，具有一定的力学强度和可塑性。目前用作组织工程的生物材料主要有两大类：1.人工合成高分子材料：聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乙烯醇、聚氨酯、聚酸酐；2.天然生物材料：壳聚糖、胶原、海藻酸盐与天然珊瑚等。
壳聚糖作为自然界唯一存在的阳性多糖，作为组织工程支架材料具有细胞黏附性强，促进细胞分化增殖，良好生物相容性和可生物降解；高表面积/体积比，一定的机械强度和可塑性。因此我们用干热交联NaCl致孔与冰冻干燥法分别制备了两种壳聚糖支架样品，通过体内外实验对比分析两种支架在孔隙率，吸水性能、机械力学性能、降解率以及细胞组织相容性等方面的差异。相比冰冻干燥法，初步探讨干热交联NaCl致孔作为新的简便可行的方法在制备壳聚糖三维立体支架中的可行性和安全性，为进一步研究工作打下基础。
材料和方法：
1.干热交联NaCl致孔制备壳聚糖支架
按一定质量比充分混合经100目网筛碾压筛过NaCl与纯化壳聚糖粉，压制成片，厚度为2mm左右，12MPa/cm2，1min。将壳聚糖-NaCl片置于105℃真空干燥箱内干热交联24h；置双蒸水中48h，溶出NaCL。浸好的壳聚糖支架真空干燥待用。
2.冰冻干燥制备壳聚糖支架
配制2wt％的壳聚糖2％乙酸水凝胶，过滤，4℃冰箱过夜去除气泡。浇注成膜，75℃冰箱24h，冷冻成型，冰冻干燥过夜。75％的酒精固定交联，双蒸水浸泡。洗过的壳聚糖胶体重新冻干过夜。
3.细胞培养与细胞吸附率
实验用支架(n=5)分为3组：CsN-1、CsN-2和冻干法。置于24孔培养板底，取0.8ml骨髓间充质干细胞(MSCs)悬液(5×104个/ml)放入孔中，37℃，5％CO2培养箱中1h；吸附后，用1ml1MPBS轻轻的漂洗试样；收集漂洗液体积=V，记数细胞浓度C，根据公式：吸附率=4×104-VC/4×104计算。
4.两种壳聚糖支架的SD大鼠皮下植入实验
SD大鼠12只，雌雄不限，体重155～205g，随机分为2组，每组6只。将灭菌支架材料(冻干法或CsN-2)埋入大鼠背部皮下组织。术后大鼠单笼喂养，每天观察并记录全身基本情况与切口区变化。定期处死大鼠(2只/组)，切取支架与周围0.5cm～1cm组织，常规切片，HE染色，显微镜下观察。
结果：
1.热交联NaCl致孔法构建壳聚糖三维立体支架(CsN-1～4)：随着NaCl/Chitosan质量比越大，所构建多孔支架的孔径越大，孔隙率越高(18～82％)，吸水性能越强(14～91％)，降解速率越快(残存质量比为75.12～88.54％)，弹性模量则下降(12.89～8.30N/mm2)。
2.冻干法制备壳聚糖支架：具有高孔隙率(98.83±0.24％)和强吸水性(96.36±0.37％)，降解快(残存质量比为58.21％)，弹性模量(1.99±0.13N/mm2)与正常生物组织最接近。
3.体外细胞培养实验表明两种方法制备的支架无细胞毒性，边缘部位均可见MSCs黏附生长。可见有分布不均的MSCs延支架互通孔洞生长分布支架内部，生长良好并分泌细胞外基质填充支架间隙。
4.SD大鼠皮下埋植实验表明两种方法制备的支架(CsN-2与冻干组)无组织毒性，刺激小，大鼠对两种材料耐受性较好。HE染色组织切片显示冻干法制备支架立体结构易崩解，降解快，不能起到暂时锚定细胞与组织塑形作用；干热交联法制备支架立体结构保持能力强，降解速度慢，与植入部位组织结合紧密，支架内部可见大量的成纤维细胞和细胞外基质分泌形成，胶原排列相对有序，可见新生血管。
结论：
1.本实验创新采用热交联，盐致孔的方法成功构建壳聚糖三维立体支架，其中以CsN-2组支架综合性能最优秀。
2.冻干法制备的壳聚糖支架具有高孔隙率和强吸水性，伸展性能与正常生物组织最接近。
3.体外细胞培养实验表明两种方法制备的支架无细胞毒性，干热交联法制备支架比冻干法更适合MSCs黏附生长增殖爬入。
4.SD大鼠皮下埋植实验表明两种方法制备的支架无组织毒性，刺激小。干热交联法制备支架立体结构保持能力强，降解速度慢，起到良好的细胞引导与组织塑形作用。
5.综合分析，干热交联法制备支架CsN-2基本性能良好，立体结构保持能力强，降解速度慢，适合中长期植入修复之需。