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外泌体是由各种类型细胞分泌的盘状囊泡,直径通常为30200 nm,可携带脂类、蛋白质、信使RNAs（mRNAs）、microRNAs（miRNAs）、非编码RNAs（ncRNAs）等多种重要的供体细胞来源的生物功能分子,并且这些分子可以通过应激或病理条件的改变而改变。这种囊泡状小体作为载体具有独特的优势,如其免疫原性低,在血液中的稳定性高,向细胞运输药物的效率高和更强的增强渗透滞留效应（EPR）等[1-3],故目前外泌体作为药物的天然内源性载体的研究受到关注,外泌体可以运送核苷酸、蛋白质和化学药物可能会成为治疗人类疾病的一种很有前途的方法,但是现在外泌体RNA等小分子的研究较多,而携带大分子蛋白质药物的研究还很缺乏。本研究中,我们在CHO细胞稳定表达外源重组蛋白的基础上,对CHO细胞分泌的外泌体中的重组目的蛋白的包载进行了分析,探索以CHO细胞这一成熟的工业用细胞作为外泌体大规模生产细胞的可行性。首先,我们培养了稳定表达Her2抗体的CHO细胞,在培养过程中,细胞的最高密度达到2.08×107 cells/mL,在day18时,Her2抗体蛋白表达量达到2.9 g/L;收取细胞培养液经ProteinA柱子纯化后收取穿透液,通过超高速离心的方法获取外泌体,使用透射电镜和纳米粒径分析仪发现,提取到的外泌体呈现双层膜的“杯状”结构,直径约为100 nm左右,属于外泌体的粒径范围。同时经Western blot检测CD63、TSG101等外泌体标记蛋白的表达,进一步证实提取的囊泡为外泌体;同时,Western blot检测结果表明外泌体中含有目的蛋白Her2抗体;通过蛋白质谱鉴定了外泌体中的蛋白数,发现Her2抗体含量在外泌体总蛋白中处于很高水平,以富集的形式存在于外泌体中。进一步将抽提的外泌体处理过表达Her2的BT474细胞,结果显示外泌体对BT474细胞的增殖有明显的生长抑制作用,说明表达Her2抗体的CHO细胞的外泌体中含有目的蛋白且蛋白是具有生物活性的。为了进一步验证实验结果不是特异性的,我们选取了另一株稳定高表达分泌性重组TNFR-Fc的CHO细胞,细胞培养后纯化培养上清收取穿透液提取外泌体,对外泌体进行电镜、粒径、形貌分析以及Western blot和蛋白质谱鉴定,证明获得了含有TNFR-Fc的外泌体。外泌体作用于L929细胞,检测结果表明:TNFR-Fc融合蛋白能中和TNF-α对细胞的杀伤作用,因此上述结果依然成立。为了探讨影响重组蛋白进入外泌体的因素,构建了三种连有不同分泌效率信号肽的EGFP重组质粒,转染CHO细胞进行瞬时表达,收取细胞上清提取外泌体,通过比较外泌体中EGFP与外泌体标记蛋白的比例,发现重组蛋白的分泌效率越高,被装载进外泌体的概率越大。同时,从表达量不同的细胞培养上清中提取外泌体,通过对外泌体中重组外源蛋白与外泌体标记蛋白的比值分析,发现细胞中外源蛋白的产量越高,被包装进外泌体的几率越大。CHO细胞是目前生产重组蛋白的最主要的表达系统,表达技术和培养技术十分成熟,蛋白表达量可以达到3-5 g/L,可以无血清悬浮培养,规模放大简便。无血清培养更避免了外泌体提取中血清的干扰,本研究证明了CHO细胞可以生产包裹有活性重组蛋白的可能性,为使用CHO细胞作为大规模生产载药外泌体的平台提供了依据。