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背景耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis，MS）是一种生长快、转化效率高的非致病性分枝杆菌。研究显示其1-3小时便可繁殖一代，生长速率是卡介苗（BCG）的10倍。低剂量的耻垢分枝杆菌对人、小鼠和豚鼠均不致病，并能很快被机体清除。耻垢分枝杆菌表达外源蛋白的水平可达结核分枝杆菌（MTB）的5-10倍，单位时间内分泌的蛋白产量比MTB高50-100倍。基于以上优势，耻垢分枝杆菌有望成为代替BCG的有效疫苗载体。已有的研究证实，MTB肝素结合血凝素（HBHA）抗原对MTB感染具有明确的治疗效果，而人白介素12（hIL-12）在针对胞内菌的细胞免疫中起着关键作用。因此，构建表达HBHA与hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌可通过融合基因表达产物有效提高单个优势抗原的免疫原性；另一方面，重组耻垢分枝杆菌能够集中靶抗原和活载体的优势，可能提高HBHA诱导机体产生免疫应答的水平和保护力，增强巨噬细胞对体内MTB的清除作用。目的采用分子生物学技术，构建了表达HBHA与hIL-12融合基因的重组耻垢分枝杆菌，并通过检测其在小鼠体内诱导的免疫应答、保护力和对感染小鼠的免疫治疗作用，以期为结核病的预防和治疗提供新的有效候选疫苗。实验方法和结果1.重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定我们根据GeneBank中查找到的结核分枝杆菌肝素结合血凝素（hbha）基因及人白介素12（hil-12）基因，分别设计两段基因的引物，用分子生物学技术构建分枝杆菌穿梭表达质粒pSMT3-HBHA-hIL12，并用电穿孔法将重组质粒转入耻垢分枝杆菌中。采用免疫荧光法和蛋白质印迹（Westernblot），分别检测HBHA和hIL-12蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达，并通过检测培养物OD600的吸光度，确定重组耻垢分枝杆菌生长状态未发生明显改变。2.重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导的免疫应答及保护力将表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌采用同源加强免疫的方法免疫小鼠，测定重组耻垢分枝杆菌在小鼠体内诱导产生的免疫应答水平，检测小鼠外周血中IFN-γ、IL-2和IL-12的表达水平和CD4+、CD8+T细胞在外周血中所占的比例。并用结核分枝杆菌感染免疫小鼠，通过检测小鼠肺部荷菌量和组织病理变化评价该重组耻垢分枝杆菌诱导的保护力。结果显示重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠产生以IFN-γ、IL-2分泌量增加为主的Th1型免疫应答，能有效减少感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量，并能有效减轻其病理损伤，诱导小鼠产生与BCG相当的保护作用，因此该重组耻垢分枝杆菌可能成为控制结核病的有效疫苗。3.重组耻垢分枝杆菌对感染小鼠的治疗作用结核分枝杆菌感染小鼠4w后，皮下接种重组耻垢分枝杆菌，检测免疫小鼠肺部荷菌量和组织病理变化。结果显示，重组耻垢分枝杆菌虽然不及化疗药物显著降低肺部荷菌量，但可以有效控制感染小鼠肺部结核分枝杆菌的荷菌量并减轻病理损伤。结论表达HBHA和hIL-12融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌可以有效控制结核分枝杆菌在小鼠体内的增殖，并能显著减少感染小鼠肺部荷菌量，可能成为控制结核病感染的免疫治疗新策略。