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[目的]研究云南省大理、德宏片形吸虫的形态及核糖体、线粒体DNA的多态性,旨在从基因水平上探讨云南省大理、德宏片形吸虫的种类及遗传变异情况。[方法]1.采集样本:从云南省大理市泰兴市场2头病黄牛的肝胆管内采集片形吸虫各10条;从云南省德宏州芒市1头病黄牛和盈江县1头病山羊的肝胆管内采集片形吸虫各10条。2.形态研究:肉眼观察片形吸虫的肩部特征及体后端的形状;测量尺测量虫体的体长及体宽;体式显微镜下观察虫体的肩部特征和生殖腔的形状,测量虫体头锥的长度、口吸盘及腹吸盘的最大直径和口吸盘到腹吸盘之间的距离。3.核糖体、线粒体DNA多态性研究:a.试剂盒抽提基因组DNA及DNA纯度的鉴定;b.引物的设计与合成;c.采用PCR技术对云南两地片形吸虫核糖体ITS、28S rDNA和线粒体nad4基因序列进行扩增及测序;d.用DNAStar7.1软件、BioEdit软件进行序列的整理和比较,并用Mega5.1软件对线粒体nad4基因序列构建分子进化树。[结果]1.通过形态分析初步得出云南省存在两种片形吸虫:肝片形吸虫和巨片形吸虫。2.获得24个片形吸虫样本的ITS序列长为922bp,16个片形吸虫样本的ITS序列长为902bp;40个片形吸虫样本的28SrDNA序列长为489bp。进行序列分析显示:完整的ITS-1长为435bp,共有5个变异位点;5.8S长为141bp,无变异位点;ITS-2长为346bp或327bp,共有8个或5个变异位点;而28SrDNA序列上有4个变异位点。依据这些变异位点可以区别出两种片形吸虫,而有的片形吸虫样本在变异位点处具有肝片形吸虫和巨片形吸虫的碱基重叠现象。结果40个片形吸虫经鉴定被分成三种:肝片形吸虫、巨片形吸虫和“中间型”片形吸虫。3.获得线粒体DNA的nad4基因序列长为470bp。测序结果分析显示,片形吸虫线粒体nad4序列的种间差异大于种内差异,经前一部分鉴定为“中间型”的样本其nad4序列与肝片形吸虫的相应序列相似性高。进化树显示云南大理地区的片形吸虫明显集聚在一起,同巨片形吸虫有明显的分支,但与文献报道的肝片形吸虫和“中间型”片形吸虫线粒体相同基因序列比较,不构成独立的分支;云南德宏地区的片形吸虫明显集聚在一起,同肝片形吸虫有明显的分支,与文献报道的巨片形吸虫线粒体相同基因序列比较不构成独立的分支。[结论]1.云南大理、德宏地区的片形吸虫从形态学初步分类,存在两种片形吸虫:肝片形吸虫和巨片形吸虫。2.用核糖体ITS、28SrDNA基因作为遗传标记来鉴别云南大理、德宏地区片形吸虫的种类,可初步分成三种:肝片形吸虫、巨片形吸虫和“中间型”片形吸虫。3.用线粒体nad4基因作为遗传标记来研究云南大理、德宏地区片形吸虫的遗传变异情况,云南地区片形吸虫存在着不同程度的遗传变异,其种内变异不明显而种间分化较为显著。