GPER蛋白在Ⅱ型子宫内膜癌信号传导通路中的作用

来源 :河北医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:axun2010
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目的:子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在我国有逐渐上升的趋势,且趋于年轻化,严重危害女性健康。根据临床观察及子宫内膜癌的病理特征,传统的子宫内膜癌分为经典的两类:Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型是雌激素依赖型,认为其发生是“无孕激素拮抗的雌激素长期作用”。这类肿瘤分化较好,雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)阳性率较高,预后好,激素治疗有效率高。Ⅱ型是非雌激素依赖型,认为其发生原因与雌激素无明确关系,因为这类肿瘤的ER、PR多呈阴性,且这类肿瘤恶性程度高,分化差,预后不好,激素治疗多无效。传统认为雌激素通过与雌激素受体结合,启动靶基因的活化、转录、翻译,进而启动相应的信号通路活化,促使细胞增殖。然而这种作用模式并没有使子宫内膜癌、乳腺癌这类雌激素依赖性肿瘤得到有效控制。近来研究表明,雌激素可以激活子宫内膜癌细胞中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路。在雌激素受体阳性的细胞中,该效应是雌激素受体依赖性的。而对于雌激素受体低表达的HEC-1A细胞是雌激素受体非依赖性的。那么,在雌激素受体低表达的细胞中,什么物质介导了雌激素活化PI3K/Akt的过程?有研究发现,在G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor,GPER)阳性表达而ER阴性表达的乳腺癌SKBr3细胞株中,雌激素和他莫昔芬可激活PI3K,引起3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-3,4,5,-triphosphate,PIP3)及Akt在细胞核及胞内质网上聚集活化,证实GPER与PI3K/Akt信号传导通路的激活有关系。因此,进一步研究GPER在子宫内膜癌发生发展中的作用机制,尤其是其在ER(-)子宫内膜癌中的作用及信号转导途径,可以进一步完善对雌激素、雌激素受体领域的认识,最终以其介导的通道为靶点制定更有效的治疗方案。本研究选用雌激素受体阳性表达的子宫内膜癌Ishikawa细胞、雌激素受体低表达的HEC-1A细胞、雌激素受体阴性的KLE细胞为研究对象,在体外实验中用雌激素(Estradiol,E2)、雌激素受体拮抗剂ICI182780、GPER拮抗剂G15处理细胞,研究GPER蛋白在Ishikawa细胞、HEC-1A细胞和KLE细胞增殖的作用及其下游可能的信号通路,探讨其在ER表达不同的子宫内膜癌细胞中的作用机制,为子宫内膜癌的靶向治疗提供新的思路。方法:1细胞培育:人子宫内膜癌细胞株Ishikawa,以含有10%胎牛血清的1640培养基培养; HEC-1A、KLE细胞株,以含有10%胎牛血清的DMEM-F12培养基培养。两种培养基中各加浓度为100U/ml的青霉素及链霉素的双抗,培养于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内。以0.25%胰蛋白酶消化传代。细胞呈单层贴壁生长,选用对数生长期进行实验。2MTT法检测E2、ER拮抗剂ICI182780、GPER拮抗剂G15对三种子宫内膜癌细胞增殖的作用。3Western Blot方法检测ER拮抗剂ICI182780、GPER拮抗剂G15对E2作用下的三种子宫内膜癌细胞中Akt、GPER、Bcl-2蛋白表达的影响。结果:1E2对三种子宫内膜癌细胞增殖的促进作用不同浓度的E02(0mol/L、10-1mol/L、10-9mol/L10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)作用三种细胞24、48、72h后,MTT测OD值,计算增殖率。结果表明E2能有效地促进Ishikawa细胞的增殖,其促增殖作用呈剂量-时间依赖关系。对ER呈弱阳性的HEC-1A细胞和ER呈阴性的KLE细胞促增殖作用较Ishikawa细胞弱。2ER拮抗剂ICI180782对E2作用下的子宫内膜癌细胞的抑制作用10-6mol/L的E2提前15min作用于细胞,然后给予不同浓度的ICI180782(0mol/L、10-9mol/L、10-7mol/L、10-5mol/L)作用三种细胞24、48、72h后,MTT检测OD值,计算抑制率。ICI180782对E2作用下的ER呈阳性的Ishikawa细胞的增殖具有明显的较强的抑制作用,呈时间-剂量依赖关系;对ER呈弱阳性的HEC-1A和ER呈阴性的KLE细胞无明显抑制作用。3GPER特异性拮抗剂G15对E2作用下的子宫内膜癌细胞增殖的抑制作用10-6mol/L的E2提前15min作用于三种子宫内膜癌细胞,然后给予不同浓度的G15(0mol/L、10-9mol/L、10-7mol/L、10-5mol/L)作用三种细胞24、48、72h后,MTT法检测OD值,计算抑制率。G15对E2作用下的Ishikawa的细胞增殖无抑制作用,对E2作用下的HEC-1A细胞和KLE细胞的增殖有明显的抑制作用,其抑制作用呈时间-剂量依赖关系。4Western Blot方法检测E2对三种细胞内Akt、GPER、Bcl-2蛋白的影响10-6mol/L的E2作用于三种细胞0h、24h、48h、72h,结果显示:经过E2作用后Akt、Bcl-2蛋白的表达量均升高,且随时间延长蛋白表达量均逐渐增加,与对照组相比差异有统计学意义。进一步分析显示:GPER蛋白在三种细胞中均有表达,且GPER在KLE细胞中表达量最高,差异有统计学意义。5Western Blot方法检测ER拮抗剂ICI182780、GPER拮抗剂G15对E2作用下的子宫内膜癌细胞Akt、Bcl-2、GPER蛋白表达的影响10-6mol/L E-52+10mol/L ICI182780、10-6mol/L E2+10-5mol/LG15处理三种子宫内膜癌细胞24h、48h、72h。结果显示:ICI182780对E2作用下的Ishikawa细胞中的Akt、Bcl-2、GPER蛋白的表达有下调作用,对HEC-1A、KLE细胞中三种蛋白无明显的下调作用。G15可以下调HEC-1A、KLE细胞中Akt、Bcl-2、GPER蛋白的表达,对Ishikawa细胞,只能下调GPER的表达,而对Akt、Bcl-2的表达无影响。结论:1雌激素对Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌细胞均有促增殖作用。2在Ⅰ型子宫内膜癌中,雌激素主要通过ER介导的PI3K/Akt/Bcl-2信号通路促进细胞增殖;而在Ⅱ型子宫内膜癌中,雌激素主要通过GPER介导的PI3K/Akt/Bcl-2信号通路抑制细胞凋亡,促进细胞增殖。3在Ⅱ型子宫内膜癌中,GPER拮抗剂G15能抑制GPER介导的PI3K/Akt/Bcl-2信号通路,抑制细胞的增殖。因此GPER及其拮抗剂G15可能成为治疗Ⅱ型子宫内膜癌的新靶点及新靶向药物。
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