论文部分内容阅读
冬虫夏草作为一种名贵中药材,具有一系列药理作用,但天然虫草的产量不断地降低。利用液体深层发酵法得到的冬虫夏草菌丝体,其有效成分与天然虫草相近,是解决虫草来源的一种有效途径。虫草多糖被证明是冬虫夏草中发挥药理作用的一种关键生物活性组分。本文利用先进的发酵过程检测仪器仪表及多参数相关分析优化了冬虫夏草(中国被毛孢)深层液态发酵工艺,建立了从发酵虫草菌粉中提取、纯化虫草多糖的工艺,进而确定了多糖的分子结构,并对其抗氧化性能进行了分析。首先,以菌体生长速率和有效成分的积累为目标,优化了冬虫夏草深层发酵的培养工艺。通过正交优化实验,得到了发酵培养基中最佳葡萄糖与酵母膏浓度配比为40：33。通过底物补料工艺研究,确定了最优的氮源流加新工艺,培养温度考察实验证实当温度控制在18℃时对菌体的生长和有效成分的积累最有利。通过溶氧浓度对生长代谢关系的考察实验,并结合剪切力对菌丝的影响实验,得到了该低耗氧发酵过程中对转速和通气量的优化控制策略,通过提高通气量来增加供氧和保证混合效果对于提升发酵虫草菌丝体的产量非常关键,需严格控制。建立了活细胞电容值和CER与发酵过程菌体生长情况的相互关系,实现了基于在线CER和活菌浓的过程底物流加及工艺控制策略。建立了底物原材料蛋白酶水解的最佳工艺,提升了底物利用率,降低了发酵成本。其次,从发酵虫草菌粉中提取、纯化了虫草多糖,确定了多糖的分子结构。利用中国被毛孢虫草菌液体深层发酵培养得到菌丝体,通过正交试验优化得到了多糖提取工艺：提取温度100℃,提取时间120min,料液比1：15,提取次数4次。粗多糖经sevage法脱蛋白、透析袋透析、DEAE离子交换和Sephadex G-100柱层析纯化后,得到3种多糖(命名为HSP-1、HSP-2和HSP-3)。经紫外扫描、Sephacryl S-300HR柱层析检测确定HSP-1和HSP-2为均一组分,HSP-3为非均一组分。苯酚—硫酸法测得HSP-1含糖量为89.42%。Sephacryl S-300HR柱层析测得HSP-1相对分子质量为1.7×104Da。GC-MS测得HSP-1单糖组成及比例为：D-葡萄糖：D-甘露糖：D-半乳糖=4.522：1：1.378。红外光谱测定结果显示HSP-1含有α型糖苷键。最后利用一系列仪器分析和化学分析方法(高碘酸氧化--Smith降解分析、甲基化分析、部分酸水解分析、GC-MS分析和红外光谱分析)对HSP-1的结构进行了预测,它是一种具有分支结构的多糖,主链主要由(1→4)-a-D-葡萄糖残基(-70%)、(1→4)-a-D-甘露糖残基(-15%)和(1→4)-α-D-半乳糖残基(-15%)构成,一部分a-D-葡萄糖残基(-8%)可以在1,2,4,6位点同时形成糖苷键,从而形成分支结构,分支主要由(1→4)-a-D-葡萄糖残基、(1→4)-a-D-半乳糖残基和(1→4)-a-D-甘露糖残基构成,非还原性末端主要由a-D-半乳糖构成。另外,对HSP-1的抗氧化性能进行了分析。HSP-1对羟基自由基的半清除率为0.834mg/mL,对DPPH自由基的半清除率为0.714mg/mL。