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急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是一种异质性的血液系统恶性肿瘤,对人类的健康构成了严重的威胁。目前,AML的临床治疗仍旧是以放化疗、骨髓移植为主。尽管治疗手段在逐渐进步,但AML患者的整体存活率仍旧很低。对于一线化疗药物产生耐药反应是导致治疗失败的最主要原因,因此继续寻求新的治疗方式是当前AML治疗的首要任务。随着生命科学和医学研究的深入发展,溶瘤病毒（Oncolytic virus）成为目前治疗恶性肿瘤的一个重要发展方向。然而,由于靶向性较弱和感染效率不足,利用溶瘤病毒治疗白血病等血液系统恶性肿瘤目前仍然受到限制。溶瘤腺病毒是恶性肿瘤溶瘤病毒疗法研究中应用最为广泛的病毒类型之一。然而,受给药方式（目前主要通过瘤内给药）的限制,溶瘤腺病毒治疗血液恶性肿瘤的研究较少。在课题组的前期研究中,我们利用亮氨酸拉链异二聚体系统,通过对腺病毒衣壳蛋白进行结构改造修饰,成功构建了一种靶向型溶瘤腺病毒载体（rAd5pz-zTRAIL-RFP-SΔ24E1a,A4）。该载体可以通过静脉给药对乳腺癌小鼠模型产生较好的治疗效果。因此,本论文希望通过对载体进行优化,进一步考察其应用于AML治疗的潜力。溶瘤腺病毒A4可以表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）,且能够利用亮氨酸拉链（zipper）连接于病毒表面,从而靶向肿瘤细胞并增强肿瘤杀伤能力。因此,论文首先检测了AML细胞系和原代细胞表面腺病毒受体和TRAIL受体的表达水平。结果显示:在永生型AML细胞系THP-1和MV4-11均表达较高水平的死亡受体DR4、DR5,但假死亡受体（DcR1和DcR2）表达水平较低,并且两株细胞均表达较低水平的腺病毒受体（CAR,整合素αvβ3和整合素αvβ5）。而在所检测的19例AML患者来源的原代细胞中,有50%以上的样本表达中等水平的DR4、DR5。这一结果对经过我们改造的重组溶瘤腺病毒载体的应用奠定了基础。前期研究发现,尽管A4病毒的衣壳表面通过zipper修饰有TRAIL,但病毒衣壳修饰的TRAIL量小于理论值。所以,为了进一步提升A4的肿瘤靶向能力,我们首先构建了C端融合亮氨酸拉链zipper E·E34单链的截短型TRAIL的融合蛋白z-sTRAIL的原核表达质粒pET-28a-z-sTRAIL,并在大肠杆菌内成功表达并纯化出z-sTRAIL蛋白。在验证了z-sTRAIL的基本生物学活性后,将z-sTRAIL蛋白与腺病毒衣壳pIX修饰有zipper R·R34单链的病毒进行体外共孵育,经过CsCl密度梯度离心的方法对其进行纯化。通过对其进行dot blot和ELISA检测后证实,经过体外优化可以得到比A4病毒衣壳TRAIL修饰量多出一倍的重组溶瘤腺病毒载体,优化后的载体命名为zA4。通过对THP-1和MV4-11细胞进行感染分析,我们发现zA4对AML细胞的感染能力明显优于A4和衣壳未经修饰的A3病毒。并且通过THP-1与病毒的结合与内在化实验进一步证明了病毒载体表面修饰的TRAIL蛋白越多,越有利于增强病毒载体对THP-1细胞的结合能力。随后通过体外的抑瘤效果评价我们可以发现,以不同MOI病毒（A3、A4和zA4）分别感染THP-1和MV4-11细胞,三种溶瘤腺病毒均可以诱导剂量依赖的AML细胞毒性。并且对人正常淋巴T细胞H9无明显杀伤。并且以相同方法对19例AML患者的原代细胞样本进行相同的细胞毒性分析,结果表明三种溶瘤腺病毒均可以对原代AML细胞造成明显杀伤,并且杀伤能力随着病毒衣壳TRAIL蛋白修饰量的增加而增强。之后,使用THP-1细胞在Balb/c裸鼠中进行了体内抑瘤效果评价。我们成功建立了皮下荷瘤模型和静脉荷瘤模型两种AML模型。在两种模型中,三种病毒均有较明显的肿瘤靶向效果和抑制肿瘤效果,并且zA4显示出最佳的肿瘤靶向能力和效果最明显肿瘤细胞杀伤能力。由于发现溶瘤病毒在部分TRAIL受体表达较低的原代AML细胞中活性并不理想,因此为了进一步提升重组溶瘤腺病毒zA4在TRAIL死亡受体相对低表达的肿瘤细胞系中的杀伤能力,我们针对TRAIL活性进行了化药筛选。研究结果表明,人参皂苷Rh2能够提升肿瘤细胞的死亡受体表达,从而增强TRAIL引起的细胞凋亡活性。并且发现在同时应用低剂量的Rh2与低剂量的sTRAIL联合后,可以降低sTRAIL的半数抑制浓度IC50,二者之间存在着较强的协同作用。之后我们分别使用永生化AML细胞系THP-1与原代AML细胞分别进行了Rh2联合zA4的体外抑瘤效果评价,发现Rh2在这两类AML细胞中均能够显著增强zA4的肿瘤杀伤能力。最后,我们利用静脉荷瘤模型对这种联合疗法进行了体内评价验证。实验结果表明,这种联合治疗的方式可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖及肝浸润现象,并且有效地延长了小鼠的生存期。综上所述,在本论文的研究中,我们通过对前期获得的靶向型溶瘤腺病毒进行优化,获得了具有更多TRAIL蛋白修饰的溶瘤腺病毒载体zA4。然后利用AML细胞系和原代AML细胞在体外细胞水平验证了zA4具有较好的抗肿瘤活性,并在裸鼠荷瘤模型中通过静脉注射的方式进行治疗性评价,证实优化后的zA4具有更强的肿瘤靶向能力及更强的抑瘤效果。此外,Rh2与zA4的联合应用增强了zA4对原代AML细胞和移植型AML裸鼠模型的靶向治疗效果。本研究提供了将溶瘤腺病毒载体应用于治疗包括AML在内的血液系统恶性肿瘤中的可行性。