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表观遗传学是近些年来人们比较关注的学科之一,和传统遗传学不同,它旨在研究:1基因如何发挥功能及基因间的互作关系;2研究范畴在于涉及DNA序列外,使基因表达模式发生改变并可使之在世代间稳定遗传的因素。其中基因沉默是表观遗传学表现形式之一,基因沉默所讨论的是:一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因不表达现象,其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。通常意义下,根据沉默发生时期的不同将基因沉默分作两大类:转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉默。 本论文在转录后水平heterochromotic siRNA(hc-siRNA)通路与RNA介导的DNA甲基化调控路径的指导下展开。为鉴定得到拟南芥新的突变植株,本论文使用Suc2启动子连接一段外源反转重复序列phytonene desaturase(PDS)导入突变植株体内,通过基因沉默通路完成生物效应。Suc2启动子是一种维管束启动子,它可在伴胞细胞中持续表达。具体作用机理是PDS在Suc2启动子作用下表达形成PDS siRNA,PDS siRNA通过降解PDS mRNA及RNA介导的DNA甲基化路径抑制PDS基因的正常表达。PDS是类胡萝卜素生物合成路径过程中的关键酶,因此叶绿素生物合成路径受阻,进而植株产生“白化”现象。本论文观察的表型是转基因植株从叶脉部位到邻近部位均有类胡萝卜素缺失所造成的植株“白化”现象,这种细胞传递表达同一种表型的现象是通过沉默信号的转移实现的。 论文以PDS为研究工具对80个突变植株进行筛选,鉴定得到7株与Jap-3植株(对照植株)表型相异的突变植株,它们的表型较Jap-3“白化”现象加强,因此这7个突变植株便是本论文的研究重点。 通过Northern印迹和Quantitative Stem-Loop-PCR(Q-SL-PCR)反应对这7个突变植株内源特异polymeraseⅣ-siRNA(p4-siRNA)的表达量进行测定。Northern印迹结果显示:植株体内可以定位到24nt大小的hc-siRNA,证明整个实验背景遵循hc-siRNA通路;Q-SL-PCR法对内源特异p4-siRNA进行量化,结果显示:与对照相比较,7个突变植株的内源p4-siRNA表达水平较野生型Col-0低;转基因植株p4-siRNA含量较Jap-3水平相当或略低;植株自身之间比较,转基因植株内源p4-siRNA含量呈现递增趋势。由此可知:PDS的作用在于增加突变植株内源siRNA含量,为下游RNA介导的DNA甲基化调控路径奠定基础。 植株体内对于突然骤增的siRNA,实验给出进一步数据证明其下游去向,即:RNA介导的DNA甲基化。论文测定了7个突变植株在三个不同染色体位点(LTR1、AtSN1、Solo LTR1)的胞嘧啶甲基化程度,结果表明:与对照相比较,7个突变植株较野生型Col-0,在三个不同染色体位点都处于不同程度“去甲基化”状态;转基因植株体内,这7个转基因植株在LTR1位点甲基化水平高于Jap-3,在AtSN1和Solo LTR1位点甲基化水平有些转基因植株与Jap-3相当,有些转基因植株在这两个位点甲基化水平略低于Jap-3。植株个体之间对比,每个突变植株和其对应的转基因植株,在三个不同染色体位点都呈现出由不同程度“去甲基化”向“甲基化”状态发展的趋势,只有一个突变植株在胞嘧啶甲基化路径上表现不敏感,推测其siRNA下游路径的生物事件可能是组蛋白共价修饰或DNA甲基化与组蛋白共价修饰的协同作用。 最终,此论文得到以下结论: 1、建立了自己的通路模式图; 2、PDS对siRNA含量起到补偿作用:使突变植株体内siRNA含量与Jap-3体内的siRNA含量维持在同一水平。在转基因植株和Jap-3背景相同的状态下,转基因植株的“白化”程度类似Jap-3:然而,转基因植株的“白化”程度却强于Jap-3,原因在于这一生物事件是由RNA介导的DNA甲基化下游路径调控所致,从而建立DNA甲基化与植株“白化”现象之间的关系; 3、推测这7个突变植株的突变基因对植株“白化”加强现象有贡献,与基因沉默通路相关。