研究背景丰富环境（Enriched environment,EE）最初是由加拿大科学家Hebb于1947年提出的,他发现EE中大鼠的学习记忆能力显著提高。EE是一种新兴的低成本非侵入式康复护理的治疗方法,有别于传统的药物或者手术治疗方案,其基于对各种认知、感觉、社会互动和运动的良性改变,已经被证明对许多疾病模型有着良好的治疗效果。在动物模型研究中,EE在中枢神经发育方面得到广泛研究。中枢神经系统损伤或者疾病（中风、脊髓损伤、多发性硬化症等）常引起中枢性疼痛,通常以运动功能的丧失为特征。然而,在中枢神经系统疾病模型中,对EE的研究更多关注在运动恢复和潜在的神经再生机制方面,很少关注卒中后疼痛,对于其并发症如焦虑、抑郁和学习记忆能力下降等也常被忽视。脑卒中是威胁人类健康的主要疾病之一,尤其是脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）具有高致残率和死亡率的特点。70%的脑卒中患者在6个月内会出现慢性疼痛,卒中后中枢痛（Central post-stroke pain,CPSP）约占慢性疼痛的10%,且常见于丘脑病变中,丘脑痛（Thalamic pain）属于典型的CPSP。丘脑腹侧部核群将接收到的信号从周围神经系统传递到大脑皮层的特定部位,特别是丘脑腹后外侧核（Ventroposterior lateral,VPL）主要接收来自躯体感受的信号,从延髓背侧柱核（Dorsal column nuclei,DCN）神经元的轴突横过中线到对边沿内侧丘系上行,终止于VPL。VPL神经元发出丘脑-皮质轴突投射到中央后回的躯体感觉皮质区（SⅠ区）,SⅠ区的神经元再投射到SⅡ区。关于丘脑出血后超微结构的变化的研究很少,包括神经元、髓鞘、突触和小胶质细胞改变,超微结构的观察加深对疾病的认识包括基本病变、病因和发病机制的了解。CPSP是卒中后发生的中枢性神经病理性疼痛综合征,由于脑血管病损害了中枢神经系统的躯体感觉系统而直接引起的疼痛,主要表现为脑损伤区域相对应的躯体部位的疼痛与感觉异常,持续时间长,疼痛剧烈,性质难以描述,可以被机械或温度刺激（尤其冷刺激）诱发,在卒中患者中,CPSP的患病率在1%～12%,患者难以忍受而无法有效配合功能康复训练,严重影响着患者的生活质量,可产生抑郁、焦虑等严重影响心理健康的异常情绪,伴随着认知、语言和情感等障碍,但目前尚无有效的治疗方法。EE对于疼痛的治疗有一定的积极效果,研究表明,EE通过降低神经炎症、减少神经元兴奋性、调节神经营养因子的释放和趋化因子等可改善神经病理性动物模型的痛阈,但关于EE在CPSP中的研究未见报道。CPSP出现在ICH继发性损伤进程中,血肿的溶解及其分解过程中不断产生的有害代谢产物（包括凝血酶、铁元素超载以及血红素等）,对血肿周围细胞产生强烈的细胞毒性,引发炎症反应、氧化应激等,在CPSP的产生和发展中发挥关键作用。研究表明ICH继发性损伤中神经炎症是其重要组成部分,调动免疫系统,激活相关细胞信号通路促进炎性细胞因子、趋化因子等神经毒性物质的产生,从而激发一系列炎症级联反应,介导细胞的二次损伤,加重神经病理性疼痛。小胶质细胞广泛分布于大脑中,是主要的固有动态免疫细胞,并且对病理损伤反应产生双重性的作用。小胶质细胞既具有促炎作用,也具有神经保护的功能,取决于其激活状态的变化。研究发现,在CPSP动物模型中,小胶质细胞在出血灶周围集聚并被激活,释放大量的细胞因子和炎性介质,从而引起痛觉过敏。课题组前期研究及文献表明Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）在中枢主要表达小胶质细胞上,是经典的先天性免疫受体。TLR4激活后,募集髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88,My D88）经过转导后,进一步引起核转录因子κB（Nuclear transcription factor-kappa B,NF-κB）的活化,进入细胞核后表达炎性基因。这些促炎因子损伤神经元,使其兴奋并放大疼痛信号,进而引起机体对疼痛的刺激产生过敏。综上所述,神经炎症在CPSP的发生发展起到促进作用,而TLR4的激活是小胶质细胞活化的关键点,因此通过减少TLR4受体的激活可以减轻CPSP。但是EE是否影响小胶质细胞的激活进而缓解丘脑出血后疼痛尚不明确。本研究通过应用EE治疗丘脑出血后疼痛,检测疼痛是否得到缓解、小胶质细胞激活和神经炎症通路蛋白是否降低,分析疼痛与小胶质细胞激活的相关性,同时观察学习记忆能力和焦虑抑郁样情绪是否改善。目前EE治疗疼痛的临床研究匮乏,期望EE能为CPSP的治疗方面提供相关理论基础和新方向,将EE理念转化引入疼痛患者的康复治疗中,并开展临床研究十分重要。研究目的:（1）建立丘脑出血疼痛模型,观察血肿周围组织形态学及超微结构变化。（2）阐明丰富环境对丘脑出血后疼痛的缓解及其作用机制。研究方法:（1）建立丘脑出血模型,观察血肿周围组织形态学及超微结构变化随机将小鼠分为Sham组和CPSP组,参照小鼠脑图谱,运用Evans blue进行定位训练。立体定位向VPL区域注射Ⅶ-s型胶原酶,建立丘脑出血模型。并在各实验时间点检测体重、神经功能、机械痛和冷痛变化。术后Day 1（D1）新鲜切片,检测血肿位置并统计血肿体积。选择丘脑出血后Day 3（D3）,使用CV/LFB染色方法检测脱髓鞘变化,通过FJC染色检测观察血肿周围神经元的变性,同时使用透射电镜观察紧邻血肿周围的组织超微结构变化。（2）应用EE对CPSP进行治疗,评估EE的治疗效果,并探索其机制。首先将小鼠经过术前行为学剔除后,随机分配到Sham组、CPSP组和治疗组（CPSP+EE组）。在EE的治疗过程中,检测各时间点体重、神经功能、机械痛和冷痛的变化。在治疗后Day 14（D14）通过行为学检测学习记忆和焦虑抑郁样情绪的改变,CV/LFB观察血肿周围髓鞘的变化,采用免疫荧光染色检测损伤周围小胶质细胞（Iba1）和星形胶质细胞（GFAP）激活的改变。对D14疼痛产生和EE治疗后疼痛的缓解,与胶质细胞激活的面积进行相关性分析,应用Western blot（WB）的方法检测TLR4/My D88/NF-κB信号通路蛋白表达情况。研究结果:（1）通过玻璃电极将Evans blue显微注射到VPL区域后2h,新鲜切片,与小鼠脑图谱VPL位置及形状进行对比,位置准确。注射胶原酶后,术后D1,与Sham相比并统计血肿的体积（P<0.05）。与Sham相比CPSP组体重和神经功能评分无明显变化（P>0.05）,术后D1机械痛开始明显的上调（P<0.05）,冷痛在术后D3有显著性升高（P<0.05）,一直持续到D14。与Sham组相比,在术后D3出血灶周围的CV/LFB显示神经元髓鞘减少,并出现脱髓鞘化。与Sham组相比,FJC染色出血灶周围出现变性神经元。与Sham组相比,在出血灶周围免疫荧光染色小胶质细胞（Iba1）激活。通过透射电镜观察损伤后D3时的脑组织超微结构变化,与Sham相比较,血肿周围可见红细胞、神经元和小胶质细胞形态的改变以及在神经元及小胶质细胞中可以观察到线粒体发生肿胀、空泡化和脊断裂模糊,内质网和高尔基肿胀破碎等细胞器的病变。统计结果显示与Sham组相比,血肿周围髓鞘数量减少（P<0.05）,髓鞘板层松解,明显的脱髓鞘化（P<0.05）,突触数量的减少（P<0.05）。观察丘脑出血后,小胶质细胞发挥吞噬功能,及这个过程中小胶质细胞的形态变化及细胞器的病变。（2）检测EE的治疗效果,Sham组、CPSP组和CPSP+EE组对疼痛的敏感程度变化,EE改善丘脑出血后疼痛,并改善CPSP后出现的学习记忆障碍和焦虑抑郁样情绪。与Sham组比较,在术后D1,CPSP组机械痛明显的上调（P<0.05）,冷痛在术后D3有显著性升高（P<0.05）,一直持续到D14,CPSP+EE组在术后Day7（D7）（介入EE后第2天）后机械痛和冷痛有明显的改善,一直持续到D14（P<0.05）。通过Y迷宫和新物体识别实验检测小鼠学习记忆功能,与Sham组相比,CPSP组在术后D14出现学习记忆障碍（P<0.05）,EE治疗后可以得到显著改善（P<0.05）;通过十字高架和旷场实验检测焦虑样情绪改变,与Sham组相比,CPSP组在术后D14出现焦虑样情绪（P<0.05）,CPSP+EE组相比于CPSP组焦虑样情绪得到改善（P<0.05）;悬尾和强迫游泳实验检测抑郁样情绪改变,EE的治疗改善CPSP组在术后D14出现的抑郁样情绪（P<0.05）。（3）在术后D14,EE改善CPSP后的脱髓鞘化,减弱胶质细胞的激活,降低TLR4信号通路蛋白的表达。与Sham组相比,CPSP后D14髓鞘减少（P<0.05）,EE治疗后脱髓鞘化得到改善（P<0.05）。在术后D14,与Sham组相比,CPSP组小胶质细胞和星形胶质细胞显著激活（P<0.05）,EE治疗后小胶质细胞和星形胶质细胞的激活减少（P<0.05）。Pearson积矩相关/Spearmen秩相关性分析结果,在术后D14疼痛的产生与胶质细胞的激活有相关性（P<0.05）,EE治疗后疼痛的缓解与胶质细胞的激活减弱有相关性（P<0.05）,除0.07g机械痛检测,疼痛的缓解与星形胶质细胞激活不具有相关性（P=0.092）,且疼痛与小胶质细胞的相关性强于星形胶质细胞,WB检测结果显示TLR4、My D88和NF-κB蛋白表达在CPSP后相比于Sham组升高（P<0.05）,EE治疗后蛋白表达降低（P<0.05）。研究结论:丰富环境治疗缓解丘脑出血后疼痛,改善学习记忆功能及焦虑抑郁样行为,其机制可能是抑制小胶质细胞的激活,降低TLR4信号通路表达。