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研究目的探究miR-143-3p对人胆囊癌血管生成的调控机制。胆囊癌是胆道系统中最常见的恶性肿瘤。其发病率居消化道肿瘤第7位,虽然其发病率较其它消化道肿瘤偏低,但其恶性程度极高,早期症状不典型,肿瘤进展快,胆囊癌近些年有取代胰腺癌成为新一代的“癌中之王”的趋势。由于胆囊癌对放化疗不敏感,手术切除成为其唯一根治的方法,然而多数病人确诊时已发生了远处转移,失去了手术机会。我们前期研究发现miR-143-3p在胆囊癌组织中较癌旁组织表达明显下调,所以我们选取miR-143-3p作为研究对象。已有研究表明miR-143-3p在其它癌症中发挥抑癌基因的作用。然而,miR-143-3p在胆囊癌中的作用还未阐明。同时血管生成在恶性肿瘤的发生和发展中起着举足轻重的作用。因此,本课题旨在探究miR-143-3p在胆囊癌血管生成中的作用机制。材料与方法(1)本实验室前期应用human microRNA microarray检测分析了4对胆囊癌组织及癌旁组织中差异表达的miRNAs,其中miR-143-3p在癌组织中较癌旁组织中表达量明显下调。进一步在49对胆囊癌组织与癌旁组织中验证miRNAs芯片的结果,并分析miR-143-3p的表达与胆囊癌临床预后的相关性。(2)实时定量PCR检测各胆囊癌细胞系中miR-143-3p的表达水平。构建miR-143-3p模拟物(mimic)和抑制物(inhibitor),转染胆囊癌细胞系,达到上调及下调miR-143-3p表达量的目的。继而通过体外细胞增殖实验和体内裸鼠移植瘤实验研究miR-143-3p对胆囊癌细胞增殖的影响;通过体内和体外血管生成实验,研究miR-143-3p对胆囊癌血管生成的影响;通过血管生成因子蛋白芯片,研究miR-143-3p对血管生成因子的影响,并应用ELISA及Western blot等方法验证血管生成因子蛋白芯片结果。(3)结合TargetScan、PicTar和miRDB等生物信息学软件预测miR-143-3p的下游靶基因,并应用双荧光素酶报告基因实验验证miR-143-3p对其靶基3’UTR的作用。过表达ITGA6与miR-143-3p共转染胆囊癌细胞后进行细胞功能及Western blot等回复实验,验证两者间的调控关系。结果(1)qRT-PCR检测miR-143-3p在49对胆囊癌组织中较癌旁组织表达明显下调,与前期4对胆囊癌组织及癌旁组织miRNA芯片数据一致。结合相应的临床数据分析发现,miR-143-3p的表达水平与肿瘤大小(P<0.05)及肿瘤浸润深度(P<0.05)相关,Kaplan-Meier生存分析显示,miR-143-3p低表达组患者的中位生存期明显短于高表达组患者(9.86个月VS.26.92个月,P<0.001)。(2)miR-143-3p在NOZ细胞中相对低表达,而在GBC-SD细胞中相对高表达,所以选取这两株胆囊癌细胞系进行相应细胞功能学实验。体内体外血管生成及细胞增殖实验证实过表达miR-143-3p可抑制胆囊癌血管生成能力,同时也可抑制胆囊癌细胞增殖能力。血管生成因子蛋白芯片结果显示,过表达miR-143-3p后,PLGF表达明显下调,提示miR-143-3p通过调控PLGF的表达从而实现其抑制血管生成的功能。(3)双荧光素酶报告基因、Western blot等实验证实ITGA6为miR-143-3p的直接靶基因。(4)Western blot实验及回复实验结果显示miR-143-3p通过直接作用于ITGA6从而达到调控PLGF表达。结论miR-143-3p通过靶向作用于ITGA6从而抑制PLGF的表达,进而抑制胆囊癌细胞增殖能力及血管生成。