第一章　胃癌促淋巴管生长因子检测及其临床意义 胃癌(Gastric cancer，GC)进展过程伴随着血道转移和淋巴道转移现象，后者更为常见。淋巴道转移是一个多步骤、多因素参与的复杂过程，肿瘤细胞的淋巴管侵犯(1ymphatic vessels invasion，LVI)为其初始步骤，而肿瘤淋巴管生成(lymphangiogenesis)为该初始步骤的中心环节，促淋巴管生长因子在其中起关键作用。这些细胞因子的血清浓度变化有可能反映胃癌生物学行为和肿瘤进展情况，对该问题的阐述有利于寻求胃癌筛查、诊断、术前分期、预后评估、术后复查的新指标。本研究拟用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测胃癌患者术前外周血、术中瘤旁血、术后外周血中相关促淋巴管生长因子(VRGF-C、VEGF-D、HGF、PDGF-BB)的血清浓度，与非肿瘤患者外周血浓度相比较，并分析其与肿瘤临床病理参数的关系。 【目的】检测胃癌患者术前外周血、术中瘤旁血、术后外周血中促淋巴管生长因子VRGF-C、VEGF-D、HGF、PDGF-BB血清浓度及其与临床病理参数的关系，探讨其作为胃癌筛查、诊断、术前临床分期、淋巴结状况判断、预后评估指标的可能性。 【方法】病例源于中山大学附属第一医院胃肠胰外科2007年1月到2007年11月的住院患者。符合病例入选标准的胃癌患者108例和同期住院的非肿瘤择期手术病例36例。胃癌病例分别取术前外周静脉血、术中瘤旁静脉血、术后7d外周静脉血，对照组仅取术前外周静脉血。用血清分离管(serum separator tube，SST)收集血样，术前血于晨起空腹时或麻醉后于静脉通路建立前用真空采血器取患者上肢静脉血。瘤旁静脉血于开腹探查结束后，于肿瘤表面或近肿瘤处选较粗静脉血管抽取，术后血于术后7d空腹状态下于患者上肢静脉抽取。取血量约2ml，于室温下凝固30分钟或4℃保存2小时后2000rmp离心10分钟。吸出血清，-20℃储藏、待测。ELSA定量试剂盒检测血清VEGF-C、VEGF-D、HGF、PDGF-BB光密度值(OD，optical density)，OD值经CurveExpert处理获取标准曲线和回归方程，计算血清浓度。胃癌患者为试验组(Gastric cancer group，GC组)，非肿瘤患者为对照组(NO-Gastric cancer group，NGC组)。对GC组和NGC组之间的术前外周血促淋巴管生长因子浓度进行比较；对GC组术前、术后外周血及术中瘤旁血促淋巴管生长因子浓度进行比较；对不同浸润深度、淋巴结转移状况、TNM分期下的促淋巴管生长因子血清浓度进行比较。浓度测试值均为计量资料，用均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验(t-Test)，多组间比较行单因素方差分析(ANOVA)。胃癌患者临床病理参数中的计数资料行卡方检验，计量资料行单因素方差分析，各因素之间的相关分析采用Pearson检验。全部数据采用SPSS13.0 for windows统计学软件包进行统计分析，P<0.05为有统计学意义。 　　【结论】 胃癌患者术前VEGF-C、VEGF-D、HGF、PDGF-BB外周血清浓度较非肿瘤患者显著升高，提示上述细胞因子浓度的检测可作为胃癌筛查和诊断指标。胃癌患者的瘤旁血VEGF-C、HGF浓度显著高于外周血，而VEGF-D、PDGF-BB的瘤旁血与外周血浓度无显著差异，提示VEGF-C、HGF可能为血管、淋巴管内皮细胞的主要趋化因子。胃癌根治术后7d，VEGF-C浓度显著低于术前水平，提示术后早期监测VEGF-C外周血浓度可用于评估手术根治程度和肿瘤复发的可能性。VEGF-D、HGF、PDGF-BB术后7d的外周血清浓度显著高于术前水平，表明上述3个细胞因子参与了胃癌根治术后创面的修复过程，评估其能否作为胃癌术后的复发指标应延长观测期。胃癌患者外周血及瘤旁血VEGF-C、VEGF-D、HGF、PDGF-BB浓度水平与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期密切相关，提示胃癌促淋巴管生长因子血清浓度检测有可能成为胃癌诊断、术前分期、预后评估指标。VEGF-C、VEGF-D、HGF、PDGF-BB参与了肿瘤进展和淋巴道转移，降低上述细胞因子的血清浓度或阻断其信号传导通路有可能成为胃癌的治疗靶点。 第二章　胃癌胃周软组织微小脉管形态学变化规律的实验研究 目前，胃癌根治术的内容主要包括原发病灶(包括全胃或部分胃切除)和受侵器官切除、淋巴结清扫等三个方面。而对胃周软组织的清扫未予重视，也未有相关理论提出。作为联系胃与周围器官、淋巴结的胃周软组织，其同时也是胃癌发生远处器官和淋巴结转移的中间环节。因此，对胃癌发生后胃周软组织病理变化的深入研究将有助于胃周软组织概念的确立，也有助于明确胃癌胃周软组织清扫的临床意义和界定胃癌淋巴结清扫过程中的合理界面。本课题以胃癌原位荷瘤裸鼠的胃周软组织为试验材料，对其中微小脉管的形态学变化进行观察，并与正常组织对比，为进一步的临床研究提供试验方法和思路。 　　【目的】采用酶组织化学方法观察胃癌胃周软组织中微小血管、淋巴管的形态与密度变化规律，为进一步临床研究胃癌胃周软组织的病理变化提供实验方法和思路。 【方法】将S6C-7901胃癌细胞株接种于正常裸鼠腋窝皮下，制成裸鼠皮下瘤模型，成瘤后取出，切成瘤组织块种植于正常裸鼠皮下制成第二代皮下瘤模型。待第二代皮下瘤直径为0.8cm左右时，剥取瘤体，切成约1×1×1mm3瘤组织块，在手术显微镜下将瘤组织块原位接种于裸鼠腺胃前壁，共91只，为实验组或荷瘤组(T组，Tumor group)，自接种后一周起，每隔一周处死10只，分别列入T1～T9组。6周龄未植瘤裸鼠30只，为对照组或正常组(C组，Control group)，于6周龄、10周龄、14周龄各处死10只，分别列为C1、C2、C3组。处死的裸鼠开腹取胃周软组织，液氮保存，标本行冰冻切片，分别行5’-核苷酸酶(5’-Nase)、碱性磷酸酶(ALPase)单染色及5’-Nase-ALPase双重染色，部分标本行HE染色。切片封片后，先观察胃周软组织中淋巴管、血管的大体形态、分布，后行图象分析。用低倍镜(40×)观察胃周软组织中的微小淋巴管、血管分布和形态，按管道密度从高到低顺序，每张切片挑选5～10个视野，淋巴管和血管视野分开挑选；再转成100倍视野，打开成像系统拍摄并分类保存图片。淋巴管拍摄视野用双染或5’-核苷酸酶(5’-Nase)单染切片，血管拍摄视野用双染或碱性磷酸酶(ALPase)单染切片。Image pro plus 4.5程序对胃周软组织中的微小淋巴管、血管进行图像分析，直径以像素(pixels)为单位，面积以像素平方(pixels2)为单位，密度以个／pixels2为单位，分析指标包括面积(Area)、每个视野淋巴管数目(Object)、最大直径(Diameter max)、最小直径(Diameter min)、平均直径(Diameter mean)、不规则程度(Rondness)、密度(Density)等。所有数据均为计量资料， Excel形式保存，SPSS13.0 for windows统计学软件包进行统计分析，P<0.05为有统计学意义。 　　【结论】SGC-7901胃癌细胞株(淋巴结转移性胃腺癌)裸鼠原位移植瘤模型能较好的反映胃癌的肿瘤生物学行为。5，-Nase-ALPase双重染色能有效区分胃周软组织中的微小淋巴管和血管。随着鼠龄增长，成年正常裸鼠之间胃周软组织的微小淋巴管和血管形态、管径、密度、不规则程度均无明显变化，提示此周龄段的裸鼠胃周软组织微小脉管己发育完全并处于稳定状态。正常成年裸鼠与早期荷瘤裸鼠胃周软组织中，有部分淋巴管、血管分处于静息状态，表现为无管腔实性结构，随肿瘤进展，开放脉管数量增多。正常及荷瘤裸鼠胃周软组织的淋巴管不规则程度较血管高。在肿瘤生长早期，胃周软组织中淋巴管、血管的形态变化与正常裸鼠无显著差异。随肿瘤进展，胃周软组织的淋巴管密度增加、管径增粗；而血管的变化以管径增粗或面积增加为主。肿瘤实质中存在淋巴管分布，其中可见肿瘤细胞，可能为肿瘤淋巴道转移途径之一。胃周软组织的新生淋巴管参与了肿瘤淋巴道转移过程，对胃癌胃周软组织变化的研究有助于改观现有的分期方法和治疗思路。