研究背景原发性肝癌是全球高发的恶性肿瘤,据国际癌症研究中心估计,2000年全球肝癌发病人数56.4万,肝癌死亡54.9万;其中中国肝癌发病人数30.6万,死亡30.0万,中国的发病（死亡）数占全世界肝癌的一半,由此可见,原发性肝癌是威胁人类健康的主要疾病之一。我国现有癌症病人约250万人,平均每死亡5个人中就有一个死于肝癌,每年因治疗而支付的医疗费用达300多亿元,间接损失更高达上千亿元。目前临床上的治疗一般视手术、放疗、化疗为三大支柱,但由于肝癌起病隐匿,恶性程度高,发展变化快,患者就诊时往往已进入中晚期,失去了最佳手术时机,而大多数化疗药物虽可抑制肿瘤细胞过度增生,但毒副作用大,对正常组织细胞也有很强的杀伤作用,部分病人因身体极度虚弱已不能耐受西医西药的治疗。而中医药在治疗肝癌方面因其独特的优势而被临床所广泛采纳,在治疗局部的同时,重视全身治疗,改善和提高病人的生活质量,延长生命周期,并且副作用小,因此,发挥我国中医药的优势,为肝癌的治疗寻求高效低毒、价廉质优的中药复方,并探讨其作用机理,对于提高肝癌患者生存质量,降低肝癌治疗费用,扩展中药复方应用范围,具有十分重要的社会效益,显著的经济效益和学术价值。中医理论认为,肝癌的发病是在内外因共同作用下,机体阴阳失调,脏腑功能障碍,经络阻塞,气血运行失常,气滞血瘀,湿聚痰凝,郁久化火,终致气、血、湿、热、瘀、毒互结而发病。关于本病的辩证施治,临床治疗常选用活血化瘀、清热祛湿以及养阴柔肝等治法组方。但本病病机复杂,病症危重,往往多型并见,治疗本病较为棘手。目前研究认为,中药复方治疗肝癌机理主要体现在以下几个方面:直接杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡分化、调节机体免疫功能以及影响癌基因表达等,但对以上三种不同治法中药复方治疗肝癌机理的比较研究还少有报道。目的通过本课题的研究,探讨中医活血化瘀、清热祛湿、养阴柔肝三种治法治疗肝癌的作用机制,比较其不同作用靶点,为中药复方治疗肝癌提供理论依据。方法1.无菌抽取H₂₂瘤细胞(浓度为1×10⁷ mL^-1),小鼠右侧腋下消毒后接种0.2 mL。2.以活血化瘀、清热祛湿、养阴柔肝三方最佳浓度（由预实验结果确定）中药水煎液,灌胃H₂₂荷瘤小鼠,观察其一般情况（包括毛发色泽、饮食情况、活动度等）。3.称量各组瘤体重量,计算抑瘤率,分析三种治法方药对肿瘤细胞生长的抑制作用。4.显微镜下观察瘤体组织细胞形态学变化。5.称量各组脾脏重量,计算脾指数,分析三种治法方药对荷瘤小鼠免疫功能的影响。6.应用TUNEL技术,检测瘤体细胞凋亡情况,计算凋亡指数。7.应用免疫组化技术,对细胞内细胞周期及凋亡细胞相关蛋白（CyclinD1、PCNA、Bcl-2及Bax）表达水平进行分析,探讨三种治法方药抑制瘤体细胞增殖、诱导细胞凋亡的不同作用机制。结果1.小鼠移植性肝癌(H₂₂)模型复制成功,4天后肉眼可见皮下实体瘤,成功率100%。2.活血化瘀、清热祛湿、养阴柔肝组抑瘤率分别为:43.64%、50.91%、45.45%。3.活血化瘀、清热祛湿、养阴柔肝方对H₂₂小鼠脾重无显著影响（P＞0.05）。4.活血化瘀、清热祛湿、养阴柔肝方对肝癌细胞增殖影响显著（P＜0.05）。5.活血化瘀、清热祛湿、养阴柔肝方对肝癌细胞凋亡影响显著（P＜0.05）。6.免疫组化显示:活血化瘀、清热祛湿、养阴柔肝方作用后,肝癌细胞PCNA、CyclinD1、Bcl-2表达量减少,Bax表达量增多,与模型对照组比较有显著性差异（P＜0.05）。结论1.三种治法均具有抑制肝癌瘤体生长的作用,其中清热祛湿方的抑瘤作用最明显。2.三种治法均可以降低PCNA在H₂₂肝癌细胞内的表达量,抑制细胞内DNA合成进程,进而抑制肝癌细胞的增殖。3.三种治法方药均可以明显抑制肝癌细胞CyclinD1表达,推断三种治法能够抑制肝癌细胞增殖活性的分子机制,可能是通过降低肝癌细胞内CyclinD1的阳性表达,阻断CyclinD1-CDK4-Rb通路,降低细胞周期转换速度实现的。4.三种治法均可诱导肿瘤细胞发生凋亡;相关蛋白Bcl-2、Bax可能是三种治法诱导肝癌细胞凋亡的重要调控因子。5.活血化瘀方法主要通过抑制肝癌细胞增殖发挥抑癌作用。6.清热祛湿、养阴柔肝方法主要通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抑癌作用,二者作用结果相似。