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第一部分CC10在RSV感染毛细支气管炎住院患儿疾病严重程度评估中的作用研究目的:呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)是婴幼儿下呼吸道感染最重要、最常见病毒病原体,临床上尚无合适生物学标志物来评估RSV感染毛细支气管炎疾病严重程度。Club细胞10KDa蛋白(Club cell protein 10KDa protein,CC10)是由呼吸道上皮细胞中Club细胞分泌产生,具有抗炎和免疫调控作用。临床研究发现,CC10水平与支气管哮喘、COPD等疾病患者疾病严重程度呈负相关关系。课题组前期研究发现,在RSV感染BALB/c小鼠急性期,Club细胞数目明显减少,RSV感染与CC10水平降低必然存在密切联系。在临床研究上,CC10水平与RSV感染及其疾病严重程度的关系尚未研究报道。方法:根据纳入排除标准,总共纳入51例RSV感染毛细支管炎住院患儿,收集患儿住院第一天鼻咽抽吸物(NPA),以及18例胃肠外科同年龄组拟行腹部手术且无呼吸道感染患儿NPA作为对照。通过Wang等制定的评分系统对RSV感染毛细支气管炎住院患儿疾病严重程度进行评分。通过荧光定量PCR和ELISA检测和比较两组儿童NPA中CC10基因和蛋白水平,分析CC10水平与疾病严重程度相互关系。结果:(1)在mRNA水平上,RSV感染毛细支气管炎住院患儿NPA中CC10基因SCGB1A1/GAPDH相对表达值为1.112±0.3659(n=30),显著低于对照组(11.86±3.495,n=15)(P<0.001)。ELISA检测发现,RSV感染毛细支气管炎住院患儿NPA中CC10蛋白水平为27.39±2.962ng/ml(n=51),显著低于对照组(58.97±6.342ng/ml,n=18)(P<0.001)。(2)根据Wang等临床严重程度评分标准,将RSV感染所致毛细支气管炎住院患儿分为轻度组、中度至重度组;中度至重度组患儿CC10蛋白水平为17.02±3.186ng/ml(n=13)显著低于轻度组患儿(30.93±3.668ng/ml,n=38)(P<0.05)。(3)通过相关性分析,发现CC10蛋白水平与RSV感染毛细支气管炎疾病严重程度呈负相关关系(r=-0.35,P<0.01)。受试者工作曲线即ROC曲线提示CC10蛋白水平可较好区分RSV感染毛细支气管炎的疾病严重度,即曲线下面积(AUC)为0.7782,临界点为<18.98ng/ml,敏感度为91.67%,特异度为62.16%。结论:RSV感染毛细支气管炎患儿NPA中CC10水平显著降低;CC10水平高低与RSV感染毛细支气管炎疾病严重程度呈负相关关系。NPA中CC10蛋白水平可作为评估RSV感染毛细支气管炎住院患儿疾病严重程度的生物学指标。第二部分CC10在RSV感染后小鼠气道炎症与AHR中的作用研究目的:RSV是造成婴幼儿下呼吸道感染最主要病原体之一,目前尚无针对RSV感染的特效治疗措施。呼吸道上皮细胞包括Club细胞是RSV感染的主要靶细胞。CC10,主要是由Club细胞分泌产生,是呼吸道中最丰富分泌蛋白之一。CC10在多种呼吸道炎症性疾病中具有明确抗炎与免疫调控作用;CC10在RSV感染中作用尚未完全清楚。本部分研究拟通过建立RSV感染小鼠模型,外源性给予重组CC10蛋白以观察CC10是否改善RSV感染所致小鼠气道炎症与AHR。方法:(1)6-8周雌性BALB/c小鼠,随机分成空白组(Mock组),RSV感染1天组(RSV1d组)、RSV感染3天组(RSV3d组)、RSV感染5天组(RSV5d组)。麻醉后,Mock组滴鼻给予100μl HEP-2细胞培养上清,RSV组滴鼻给予100μl含6.1×107PFU/ml的RSV病毒液。收集不同时间点小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF),通过ELISA检测BALF中CC10蛋白水平。(2)6-8周雌性BALB/c小鼠,随机分成Mock组,RSV5d组、RSV5d+CC10组。RSV5d+CC10组小鼠,在感染后12小时,滴鼻给予重组CC10蛋白(25μg/只)。在感染后第5天,检测气道阻力。收集小鼠BALF,ELISA检测BALF中CC10水平;BALF中细胞进行炎症细胞分类计数。左肺固定包埋后,HE染色行组织病理学检测。右肺用于提取RNA和蛋白质,通过Taqman探针法PCR检测肺组织中RSV的N基因拷贝数。结果:(1)与Mock组小鼠(121.2±5.7 ng/ml)相比,RSV1d组、RSV3d组、RSV5d组小鼠BALF中CC10蛋白水平显著降低,其值分别为89.40±3.687 ng/ml、73.99±11.91 ng/ml、56.69±4.602 ng/ml。在RSV感染第5天,给予重组CC10蛋白,显著恢复RSV感染后降低的CC10蛋白水平,其值为102.1±14.43 ng/ml,P<0.05。(2)在感染第5天时,给予重组CC10显著降低RSV感染后小鼠AHR,显著减少RSV感染后小鼠气道内炎症细胞募集,显著减轻RSV感染后肺部炎症病理损害。(3)在感染第5天时,给予重组CC10显著降低小鼠肺组织中RSV N基因拷贝数。结论:RSV感染BALB/c小鼠急性期BALF中CC10水平显著降低。外源性给予CC10显著减轻RSV感染后小鼠气道炎症与AHR。第三部分c PLA2、COX2和ALOX5在RSV感染后小鼠气道炎症与AHR中的作用研究目的:胞浆型磷脂酶A2(Cytosolic phospholipase A2,c PLA2)与多种病毒复制相关;抑制c PLA2活性显著降低RSV感染A549细胞后促炎症因子的产生。通过环氧酶2(Cyclooxygenase 2,COX2)基因敲除鼠证实,作为c PLA2下游中前列腺素合成关键限速酶,COX2的缺失可增强抗流感病毒免疫反应,减轻流感病毒引发的小鼠气道炎症细胞募集。花生四烯酸-5-脂氧合酶(Arachidonic acid-5-lipoxygenase,ALOX5)是c PLA2下游中白三烯合成关键限速酶,在RSV感染呼吸道上皮细胞中表达升高并伴随白三烯水平增高;动物模型研究发现抑制白三烯受体时,可减轻RSV感染后小鼠AHR。c PLA2、COX2、ALOX5在RSV感染后气道炎症与AHR中的作用尚未见研究报道。本文通过分别特异性抑制c PLA2、COX2、ALOX5,观察RSV感染后小鼠气道炎症与AHR变化。方法:(1)6-8周雌性BALB/c小鼠随机分成Mock组,RSV5d组与RSV5d+AACOCF3组。麻醉后,Mock组小鼠滴鼻给予100μl HEP-2细胞培养上清,RSV5d组和RSV5d+AACOCF3组小鼠滴鼻给予100μl含6.1×107PFU/ml的RSV病毒液。12小时后,RSV5d+AACOCF3组小鼠腹腔注射给予AACOCF3,注射2次,间隔6小时。之后每天给药俩次。(2)6-8周雌性BALB/c小鼠随机分成Mock组,RSV5d组与RSV5d+Parecoxib组。RSV5d+Parecoxib组小鼠在RSV感染12小时后,给予腹腔注射Parecoxib。之后每天给药一次。(3)6-8周雌性BALB/c小鼠随机分成Mock组,RSV5d组与RSV5d+Zileuton组。RSV5d+Zileuton组小鼠在RSV感染12小时后,给予腹腔注射Zileuton。之后每天给药一次。(4)以上所有组小鼠均在感染后第5天检测小鼠气道阻力。收集小鼠BALF;BALF中细胞行炎症细胞分类计数。左肺行甲醛固定后包埋,利用HE染色行组织病理学检测。右肺用来提取RNA以及蛋白质,通过Taqman探针法PCR检测肺组织中RSV N基因拷贝数,通过WB来检测小鼠肺组织中COX2、ALOX5、c PLA2、p-c PLA2蛋白水平。结果:(1)在感染第5天时,通过使用AACOCF3抑制c PLA2,显著降低RSV感染后小鼠AHR,显著减少RSV感染后气道内炎症细胞募集,显著减轻RSV感染后肺部炎症病理损害;抑制c PLA2后,显著降低肺组织中RSV N基因拷贝数。(2)在感染第5天时,通过使用Parecoxib抑制COX2,显著降低RSV感染后AHR,显著减少RSV感染后气道内炎症细胞募集,显著减轻RSV感染后肺部炎症病理损害;抑制COX2后,显著降低肺组织中RSV N基因拷贝数。(3)在感染后第5天时,通过使用Zileuton抑制ALOX5,显著降低RSV感染后小鼠AHR,显著减少RSV感染后气道内炎症细胞募集,显著减轻RSV感染后肺部炎症病理损害,但没有改变肺组织中RSV N基因拷贝数。结论:与RSV感染后给予CC10结果相一致,分别抑制c PLA2以及下游分子COX2和ALOX5,均显著减轻RSV感染后小鼠气道炎症与AHR,表明c PLA2、COX2和ALOX5介导RSV感染后小鼠气道炎症与AHR形成。第四部分CC10通过抑制c PLA2-COX2/ALOX5通路减轻RSV感染后小鼠气道炎症与AHR的作用研究目的:CC10通过抑制磷脂酶A2(PLA2)活性发挥抗炎作用。c PLA2是PLA2蛋白家族中一员;c PLA2代谢产生的AA,通过COX2和ALOX5途径产生大量前列腺素和白三烯,介导疾病炎症反应发生发展。体外实验证实:通过抑制c PLA2/COX2通路来减低前列腺素E2(PGE2)的合成,可显著降低RSV感染A549细胞后促炎症因子水平。抑制ALOX5通路中关键蛋白ALOX5、FLAP,显著减轻RSV感染后小鼠体内炎症反应。本部分将探究CC10是否通过抑制c PLA2-COX2/ALOX5通路减轻RSV感染后小鼠气道炎症与AHR。方法:通过ELISA检测第二、三部分中不同组别小鼠BALF中PGE2和半胱氨酸白三烯(cys-LTs)水平;通过WB检测第二、三部分中不同组别小鼠肺组织中c PLA2、p-c PLA2、COX2和ALOX5蛋白水平。结果:(1)在感染第5天时,抑制c PLA2显著降低RSV感染后肺组织中COX2和ALOX5蛋白水平,伴随RSV感染后小鼠BALF中PGE2和cys-LTs水平显著降低。(2)在感染第5天时,抑制COX2显著降低RSV感染后小鼠BALF中PGE2水平。(3)在感染第5天时,抑制ALOX5显著降低RSV感染后小鼠BALF中cys-LTs水平。(4)在感染第5天时,外源性给予重组CC10蛋白显著降低RSV感染后肺组织中c PLA2蛋白磷酸化水平。(5)在感染第5天时,外源性给予重组CC10蛋白显著降低RSV感染后肺组织中COX2和ALOX5蛋白水平,显著降低RSV感染后小鼠BALF中PGE2和cys-LTs水平。结论:c PLA2-COX2/ALOX5通路介导RSV感染后小鼠气道炎症与AHR形成。CC10通过抑制c PLA2-COX2/ALOX5通路减轻RSV感染后小鼠气道炎症与AHR。