低氧是一种常见的非基因毒应激,已证实机体对缺氧损伤的习服与适应受糖皮质激素(glucocorticoid, GC)的影响。在低氧条件下分泌增多的GC能通过糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)的介导,调节基因表达,但是至今对于参与了低氧适应的糖皮质激素／受体(GC/GR)的靶基因还知之不多。小G蛋白RhoB是近年来我们发现的一个新的GC/GR上调蛋白。国内外近年来的研究表明,RhoB是一个早期反应基因,能够被多种基因毒应激原(致DNA损伤),如放射线、紫外线、抗癌药(如5-氟脲嘧啶、顺铂)等上调或使其激活,并有报道RhoB上调能够促进细胞存活。考虑到RhoB是GC/GR调节蛋白,因此推测该蛋白有可能也在低氧中起作用,本课题从在体和离体两个水平观察了低氧对RhoB表达的影响,并进一步研究了低氧影响RhoB表达的机制,以进一步阐明GC对低氧适应的机制。我们首先将Sprague Dawley (SD)大鼠放入含8%02、92%N2的混合气体的低氧舱内不同时间复制急性缺氧大鼠模型,采用Real-time PCR及Western blot方法检测了大鼠肺组织中RhoB mRNA及蛋白的表达情况。结果发现,大鼠肺组织中RhoB mRNA在低氧后8h时开始上调,12h时达到最大值；而大鼠肺组织中RhoB蛋白在低氧后16h表达量最高。已有实验表明低氧暴露的动物血液中糖皮质激素明显增高,为了确定GC在机体上调RhoB表达的过程中发挥了多大的作用,我们摘取了大鼠的肾上腺以去除内源性肾上腺激素对RhoB表达的影响。我们将大鼠随机分为假手术常氧组、假手术低氧组、其余去腺后分为常氧组、低氧组、Dex组和低氧加Dex共处理组。对肺组织RhoB mRNA的检测结果显示,去腺常氧组大鼠RhoB mRNA的表达与假手术常氧组相比略有降低；去腺Dex组和去腺低氧组大鼠RhoB mRNA分别与去腺常氧组相比均有明显增高；而去腺大鼠用Dex和低氧联合处理,RhoB mRNA的表达增加更为明显。RhoB蛋白也有类似的变化。研究结果表明在体内低氧和Dex均能上调RhoB的表达,而且二者联合具有叠加或协同作用。为了排除整体低氧时体内增多的神经内分泌激素及相关的一些因子对RhoB表达的影响,考虑到肺上皮细胞和巨噬细胞是肺组织中两种最重要的细胞,我们进一步观察了低氧对体外培养的人肺腺癌细胞系A549细胞、小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞中RhoB表达的影响。将细胞置于含有1%O2的低氧孵箱,在低氧条件下培养细胞不同时间后测定其RhoB mRNA和蛋白的表达,结果发现低氧处理能快速上调RhoB mRNA和蛋白的表达。同时,我们用氯化钴模拟低氧,也得到了相似的结果。对低氧上调RhoB表达的机制研究发现,低氧能增强RhoB mRNA和蛋白的稳定性,说明低氧对RhoB的上调可以发生在转录后和翻译后水平。我们观察了MAPK家族成员(ERK, JNK, p38)在低氧上调A549细胞RhoB表达中的作用。结果发现,用ERK和p38的抑制剂处理细胞,对低氧上调RhoB没有明显影响,但是JNK的抑制剂SP600125可明显抑制低氧对胞RhoB蛋白的上调作用,同时低氧还能明显增加磷酸化JNK的水平。该结果表明低氧能通过激活JNK,上调RhoB的表达,ERK和p38则不参与该过程。我们的研究也证实Dex能在A549和RAW264.7细胞中上调RhoB mRNA和蛋白的表达。Dex时间依赖性上调RhoB蛋白表达可持续至24h甚至更长,而其对RhoBmRNA的上调非常快速,2h就达到高峰。两者虽然趋势不一致,但并不矛盾,蛋白水平的调节本来就慢于mRNA,再加上mRNA的累积,蛋白表达逐渐增多也是正常的。我们进一步观察了低氧、GC单独或联合作用对A549细胞RhoB mRNA和蛋白表达的影响。结果发现经低氧与Dex二者联合处理后RhoB mRNA的表达上调更加显著,蛋白表达也得到类似的结果,提示二者对RhoB表达有叠加或者协同作用。综上所述,本实验首次发现低氧能够在整体水平和细胞水平上调RhoB mRNA和蛋白的表达。低氧上调RhoB的表达与其提高RhoB mRNA和蛋白的稳定性有关,还有JNK通路激活参与了低氧上调RhoB的表达,而ERK和p38没有参与。本课题所得的结果为进一步研究低氧调节RhoB表达的机制和生物学意义打下了基础。