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嫁接是一门园艺技术,其成活过程包含细胞脱分化、再分化等重大理论问题。山核桃嫁接是公认的难题,为了深入探索这一珍贵物种的嫁接分子机理和调控机制,本研究采用cDNA-AFLP技术和定量RT-PCR技术对山核桃嫁接成活相关基因进行筛选、分离和生物信息学分析,结果表明:1.利用改良的CTAB法提取的嫁接样品总RNA质量高、完整性好、无杂质,适用于cDNA-AFLP分析和荧光定量RT-PCR分析。2.利用SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit反转录获得的8个实验材料双链cDNA,完整性好,满足实验要求。3.用识别4碱基和6碱基的限制性内切酶TaqI、AseI消化cDNA,所得片段长度符合技术要求。酶切片段与人工接头连接后进行预扩,获得相当浓度的200～1000bp的酶切片段拷贝。4.选用100对选扩引物进行了选择性扩增。改进选扩程序,采用高温(65℃)退火结合循环降温方法,获得高浓度的特异性产物。5.用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染对选扩产物进行差异显示,结果共获得300多条差异表达片段。经切胶回收、纯化和二次克隆等所得差异片段100多条。共测回来的序列66条,经Blast比序,除去重复序列17条,结果获得了49条TDFs。6.选取其中12条基因进行定量RT-PCR验证分析,结果显示,其中八个克隆translational initiation factor eIF-4A,3’-5’-exoribonuclease/ RNA binding (AT2G47220),18号未知基因,isolate K1/E32 K1 glycoprotein,putative auxin response factor 1,water channel (PIP1B),Glycine max catalase (cat4),65号未知基因与cDNA-AFLP的表达一致,一个克隆25号未知基因与cDNA-AFLP的表达基本一致,而其余三个克隆17号未知基因,beta family G-protein,cdc20 protein (CDC20.2)的表达与cDNA-AFLP的表达结果有差异。本实验cDNA-AFLP的表达谱中的75%得到验证。7.在49条TDFs中,有20个编码已知功能蛋白,8个编码未知功能蛋白,其余的21个与未注释的基因组序列相似,或者在核苷酸数据库无同源序列。对20个已知功能的基因进行功能分析,它们分属于物质运输,代谢和能量,细胞周期,信号转导等9类,说明山核桃嫁接过程中发生了复杂的代谢变化。根据所获得的差异表达基因,初步绘制了山核桃嫁接调控关系图,从分子水平上证实了现代嫁接的细胞生物学理论。本研究首次将cDNA-AFLP技术和定量RT-PCR分析技术应用于山核桃基因的差异表达研究,并对其加以改进,成功分离到山核桃嫁接成活相关基因。根据这些差异片段序列制作探针或转化成相应的分子标记,可以为嫁接成活基因的定位、克隆以及基因表达特性的研究提供理论依据。