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目的:本研究通过体内、体外实验对家兔及人角质形成细胞染砷,了解砷在皮肤角质形成细胞和皮肤组织中的代谢规律及内暴露剂量,观察砷对皮肤角质形成细胞和皮肤组织的影响,探讨Nrf2-ARE信号通路在砷诱导皮肤角化紊乱中的作用及砷氧化损伤的皮肤毒性机制;通过对砷诱导皮肤角化紊乱差异蛋白的研究,在蛋白质分子水平探讨砷致皮肤角化紊乱的机制并寻找敏感标记物。为砷性皮肤损伤的防治提供新的思路及科学依据。方法:1)采用MTT还原法检测HacaT细胞生长情况,确定亚砷酸钠的LC50及染毒浓度,染毒浓度分别为24h LC50的1/50、1/20、1/10,即1.30μmol/L、3.25μmol/L、和6.50μmol/L;观察时间为24h、48h、72h;2)流式细胞仪检测HacaT细胞的凋亡情况;3)将30只健康成年清洁级雄性家兔随机分为5组,每组6只,分别为对照组(去离子水)及亚砷酸钠染毒组。采用自由饮水方式连续染毒12周。染毒剂量分别为LD50的1/100、1/50、1/20、1/10,即L:0.13mg/千克体重(kg.w)、M:0.26mg/(kg.w)、MH:0.65mg/(kg.w)和H:1.30mg/(kg.w);4)染毒12周结束后,家兔背部同一部位皮肤取样,电镜下观察皮肤细胞及组织的形态学改变;5)采集家兔处死前24h尿样,并取家兔肝脏组织,采用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱(HPLC-HGAFS)法检测家兔尿、肝脏、皮肤的iAsⅢ、iAsⅤ、一甲基胂酸(Monomethylarsonic acid,MMA)和二甲基胂酸(Dimethylarsinic acid,DMA)含量;6)通过实时荧光定量PCR(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测染砷HacaT细胞和家兔皮肤Nrf2 mRNA的表达水平;7)通过相应试剂盒方法检测染砷家兔皮肤CAT、8-OHdG、MPO、GSH-Px、GST、SOD和MDA及HO-1含量或活力,总蛋白采用BCA法检测;8)用双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)筛选砷诱导角化紊乱家兔皮肤的差异蛋白点,胶内酶切后,利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)结合NCBI(nr)非冗余数据库检索对差异蛋白进行鉴定;9)用RT-PCR检测HacaT细胞CK1、CK10和家兔皮肤CK1、CK10、CK2及蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,pdi)mrna的表达水平。结果:1)1.30μmol/l亚砷酸钠染毒48h能显著促进hacat细胞增殖;3.25μmol/l亚砷酸钠染毒96h、6.25μmol/l亚砷酸钠染毒72h显著抑制hacat细胞增殖(p均<0.05);2)1.30μmol/l亚砷酸钠能抑制hacat细胞凋亡,24h时凋亡率最低;3.25μmol/l、6.25μmol/l亚砷酸钠染毒48h、72h可使hacat细胞凋亡率逐渐升高(p均<0.05);3)电镜下可见,和对照组相比各染毒组家兔皮肤细胞形态和表皮尤其是皮肤角质层结构发生了改变。0.13mg/(kg.w)砷染毒12周即可出现角化紊乱,随砷染毒剂量的升高,家兔皮肤细胞形态改变及角化紊乱程度加重;4)染毒12周后家兔尿中总砷、iasⅢ及dma含量水平随砷染毒剂量的升高呈逐渐升高的趋势,与对照组比较,h砷染毒剂量组总砷、iasⅢ及dma含量水平升高(p均<0.05)。iasⅤ含量水平无明显变化趋势。mma含量水平随砷染毒剂量升高呈现逐渐升高的趋势,与对照组比较,mh及h砷染毒剂量组其含量水平升高(p<0.05)。与对照组比较,各砷染毒剂量组pmi值均升高(p<0.05)。与对照组比较,除l砷染毒剂量组外,其余砷染毒剂量组smi值均升高(p<0.05);各染毒组家兔皮肤总砷及dma含量高于对照组,且随染毒剂量升高而升高(p<0.05);各形态砷中,dma含量最高。iasⅢ含量除mh组外,各染毒组高于对照组;iasⅤ含量各组均高于对照组,mma含量l组和h低于对照组,mh组高于对照组(p均<0.05)。兔肝脏中总砷含量水平随砷染毒剂量的升高呈逐渐升高的趋势,与对照组比较,m、mh、h砷染毒剂量组总砷含量水平升高(p<0.05)。肝脏中iasⅢ含量在各组间没有统计学差异;肝脏中iasⅤ含量m组与其他组相比升高(p<0.05)。肝脏中mma含量在各组间没有统计学差异;肝脏中dma含量在各组中不同,与对照组相比,mh和h染砷剂量组其含量升高(p<0.05)。家兔皮肤和尿中砷以dma形态为主,肝脏中各种形态砷分布未发现规律;随着砷染毒剂量升高,皮肤dma所占比例有升高的趋势。皮肤和尿的总砷和dma含量与肝脏总砷和dma含量呈正相关;5)亚砷酸钠染毒能使hacat细胞nrf2mrna表达发生改变,1.30μmol/l亚砷酸钠染毒使mrna表达上调,随着染毒时间延长、染毒浓度增加使mrna表达逐渐下调(p<0.05)。砷染毒48h后hacat细胞nrf2mrna表达水平与细胞活性呈正相关关系;l、m组家兔皮肤nrf2mrna的表达上调;mh、h组皮肤nrf2mrna的表达下调,其中l、h组与对照组相比差异有统计学意义(p<0.05)。6)染砷家兔皮肤8-ohdg在h组,mda在mh和h组比对照升高(p<0.05);cat和ho-1在m、mh和h组,gsh-px在h组比对照降低(p<0.05);gst在h组比对照升高(p<0.05);sod和mpo在各组无明显差异。染砷家兔皮肤nrf2mrna表达与ho-1、gsh-px水平呈正相关关系,与mda、8-ohdg水平呈负相关关系;7)2-de电泳蛋白斑点清晰可见,各组蛋白斑点数在100-200之间,其中对照组蛋白斑点数为119,而其余4组蛋白斑点均为129个并全部匹配。对照组和其余各组的蛋白斑点匹配率为92.24%。与对照相比差异表达的蛋白点有45个,鉴定出20种差异蛋白。其中细胞角蛋白Ⅱ型蛋白、GST-P和PDI可能与砷的皮肤毒性有关;8)细胞角蛋白Ⅱ型蛋白在各砷染毒组家兔皮肤表达,而在对照组中无表达;HacaT染砷后CK1、CK10 mRNA表达发生改变,1.30μmol/L亚砷酸钠染毒能使mRNA表达上调,随着染毒时间延长、染毒浓度增加mRNA表达逐渐下调(P<0.05);染砷家兔皮肤CK1、CK2、CK10 mRNA在L组表达上调,H组表达下降至正常或下调(P<0.05)。染砷家兔皮肤PDI蛋白表达量随染砷剂量升高而先下调后上调;PDI mRNA在MH和H组,随染砷剂量升高表达量上升(P<0.05)。结论:亚砷酸钠可在动物角质形成细胞和皮肤组织中发生生物转化并形成一系列代谢产物,随染毒剂量增加,皮肤砷负荷增加,可致皮肤氧化损伤,并引起角质形成细胞和皮肤组织Nrf2表达变化,并随染毒时间和浓度变化呈双向性;砷通过调控Nrf2水平继而影响皮肤角质形成细胞的增殖和凋亡及皮肤组织Nrf2-ARE信号通道下游酶的改变,皮肤氧化-抗氧化平衡被破坏,出现角化紊乱等形态学改变。砷代谢及Nrf2-ARE信号通路在砷致皮肤角化紊乱中发挥重要作用。差异蛋白研究发现PDI和CK1、CK2、CK10在砷诱导的皮肤角化紊乱中发挥作用;而细胞角蛋白异常是反应砷诱导皮肤角化紊乱较敏感的指标。