眼是典型的免疫赦免器官之一，它的免疫表达在许多方面不同于其他器官和组织，其独特性的维持依赖于极其复杂的调控因素。目前认为前房相关免疫偏离(anterior chamber-associated immune deviation，ACAID)是形成和维持眼免疫赦免状态的主要部分。ACAID是由进入前房的外源性抗原所激发的一种主动性、全身性的免疫反应，是局部和全身因素共同作用的结果。眼一脾轴的完整性、眼部微环境等对其诱导具有重要的作用。研究认为ACAID诱导外周免疫耐受的实质是调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)抑制炎症反应的调控过程，并证实在脾脏中可诱导两群ACAID调节性T细胞：一群是传入性的CD4+T细胞，抑制DTH的诱导；一群是传出性的CD8+T细胞，抑制DTH的表达。本研究主要关注传入性的CD4+调节性T细胞。 ACAID小鼠脾脏中分离出的CD4+T细胞抑制初始免疫反应的诱导，过继转移给同种naive小鼠，可以诱导免疫耐受。与来自non-ACAID小鼠脾脏的CD4+T细胞相比，这些来自ACAID小鼠的CD4+T细胞高分泌IL-10，而低表达IFN-γ。进一步的研究表明IL-10-producing-CD4+CD25+T细胞是ACAID形成的必需条件，同时诱导抑制性CD8+T细胞的产生。CD4+CD25+T细胞是已得到广泛认同的一群调节性T细胞，根据起源将其分为两部分：起源于胸腺的天然调节性T细胞和在胸腺外刺激产生的诱导性调节性T细胞。然而，CD25也是细胞活化的标志之一，因此需要其他的分子进一步明确这群调节性T细胞的确切表型。Foxp3，x-染色体编码的前转录因子，目前被认为是CD4+CD25+调节性T细胞特异性最强的一个标志，即CD4+CD25+Foxp3+T细胞被认为是调节性T细胞(Tregs)。此外，CTLA-4是个负性调节分子，它通过与CD28竞争性地结合同一受体CD80.CD86而调控调节性T细胞的功能；LAG-3选择性地标记诱导性调节性T细胞，并调控其功能。综上所述，ACAID是典型的眼免疫耐受的模型，在维护视觉器官免受免疫反应的破坏、维持其完整性中起着重要的作用。而CD4+CD25+调节性T细胞参与众多其他耐受模型的形成和维持，因此我们推测它也可能诱导了ACAID的形成。为了证实这一设想，我们设计了下列实验：首先在BALB/c小鼠前房注射卵白蛋白(ovalbumin，OVA)诱导ACAID，建立动物模型，以DTH反应评价ACAID是否诱导成功；其次采用流式细胞技术检测ACAID小鼠脾脏中CD4+CD25+调节性T细胞上的表达及其细胞上CTLA-4和LAG-3表达；最后，通过增殖试验和过继转移实验检测CD4+CD25+调节性T细胞的体内外抑制功能。 本课题的研究主要分为以下三部分： 第一部分 ACAID模型的诱导和鉴定。 目的:采用前房注射OVA诱导ACAID模型，为实验研究提供可靠的动物模型。 方法:采用乙醚吸入法麻醉动物，在手术显微镜下用玻璃微量注射针将2μlOVA(20mg/ml)溶液注入BALB/c小鼠前房;注射后第7d在小鼠后足垫皮下注射200μl OVA(2.5mg/ml)溶液与完全弗氏佐剂的混悬液(1∶1)；皮下免疫后第7d，于小鼠右耳廓皮内注射20μl(400μg)OVA溶液(20mg/ml)，左耳廓皮内注射相同剂量的无菌PBS溶液。24h后检测迟发型超敏反应(DTH)。 结果:DTH检测结果显示，ACAID组小鼠右耳廓均未出现明显的红肿，其耳廓肿胀数值与正常组、阴性对照组比较无明显差异，而与阳性对照组相比其耳廓肿胀度明显减小(P<0.05)，即DTH受抑制，说明ACAID模型诱导成功。 结论:前房注射OVA抗原可成功诱导ACAID，为以后的实验研究提供了稳定可靠的动物模型。 第二部分 CD4+CD25+Treg在ACAID小鼠脾脏中的表达和功能。 目的:检测ACAID小鼠脾脏中CD4+CD25+Treg的表达，及其细胞内外相关分子表达的改变。 方法 (1) 取各实验组小鼠脾脏制备单细胞悬液，FCM方法分别分析CD4+CD25+、CD4+CD25+Foxp3+在CD4+、CD4+CD25+、CD4+CD25-T细胞中的表达。 (2)制备各实验组小鼠脾脏单细胞悬液，FCM分析CD4+CD25+Treg上CTLA-4和LAG-3的表达。 结果: (1) ACAID小鼠脾脏T淋巴细胞中CD4+CD25+、CD4+CD25+Foxp3+细胞占CD4+、CD4+CD25+T细胞的比例明显过于其他实验组。90﹪以上的CD4+CD25+T细胞表达Foxp3。少量的CD4+CD25-T细胞也表达Foxp3。 (2)FCM结果显示，ACAID小鼠脾脏中CD4+CD25+Treg表达高水平的CTLA-4和LAG-3，其中LAG-3表达明显升高，但CTLA-4的表达与阳性对照组比较无显著性差异，与正常组、阴性对照组比较显著性升高。 结论:ACAID小鼠脾脏中CD4+CD25+Treg比例明显增加，这群细胞同时高表达CTLA-4和LAG-3。 第三部分 CD4+CD25+Treg在ACAID小鼠脾脏中的功能。 目的:探讨ACAID小鼠脾脏@CD4+CD25+Treg其功能特征，评价其在ACAID形成中的作用。 方法 (1) 应用免疫磁珠细胞分选方法分选各实验组小鼠脾脏CD4+CD25+、CD4+CD25-T细胞，在OVA和APC体外刺激下分别培养72h，<3>[H]-标记甲基胸腺嘧啶(<3>[H]-TdR)法分别检测CD4+CD25+、CD4+CD25-T细胞的增殖情况，并将分选的CD4+CD25+与CD4+CD25-T细胞(1∶1)混合培养，<3>[H]-TdR)法检测CD4+CD25-T细胞的增殖情况。 (2) 将分选后的CD4+CD25+与CD4+CD25-T细胞分别注入正常BALB/c小鼠尾静脉，24h后皮下免疫，7d后检测DTH反应。 结果 (1) 在OVA或OVA和APC共同刺激下，来自各试验组的CD4+CD25+T细胞几乎不增殖；而CD4+CD25-T细胞增殖明显，即使在APC单独存在下，CD4+CD25-T细胞仍有轻度增殖。 (2) 在体外混合培养试验中，来自各试验组的CD4+CD25+T细胞对CD4+CD25-T细胞均有抑制作用。在OVA刺激下，来自ACAID小鼠脾脏的CD4+CD25+T细胞抑制作用更强。 (3) 过继转移实验结果显示，将ACAID小鼠脾脏CD4+CD25+T细胞(5×10<5>个细胞/小鼠)过继转移到同种naive BALB/c小鼠体内后，OVA诱导的DTH反应受抑制，而用牛血清白蛋白诱导的DTH反应不被抑制；过继转移大量的ACAID小鼠脾脏CD4<+>CD25T细胞(5×10<6>个细胞/小鼠)也可以抑制DTH反应，提示ACAID小鼠脾脏中CD4+CD25+T细胞能够抑制抗原特异性的DTH反应，CD4+CD25-T细胞中可能也包含有调节性T细胞。 结论:ACAID小鼠脾脏中CD4+CD25+Treg具有抗原特异性的抑制功能，CD4+CD25-T细胞中可能也包含有调节性T细胞。 小结 本课题研究发现，CD4+CD25+、CD4+CD25+Treg在ACAID小鼠脾脏淋巴细胞中的比例明显增加。 CD4+CD25+T细胞体外接受OVA和APC刺激后不增殖，并抑制效应性CD4+CD25-T细胞的增殖，体内过继转移后以抗原特异性方式抑制DTH反应。这群细胞高表达负性调节分子CTLA-4和LAG-3。这些结果提示，CD4+CD25+Treg可能参与ACAID的诱导。本研究为探讨ACAID的形成机制奠定了理论基础，为眼免疫性疾病，如葡萄膜炎，角膜移植及肿瘤免疫等的预防和治疗提供新的思路。