昆虫病原真菌绿僵菌(Metarhizium acridum)是一类重要的生防微生物。国内外对其致病机理进行了大量的研究,主要集中在侵染期、侵入期和产孢期。其中侵入期即绿僵菌侵入寄主血腔,定殖、适应血淋巴这个阶段的研究对于真菌致病性的研究具有重要意义。我们课题组构建了绿僵菌侵入蝗虫体内阶段cDNA差减文库,在此基础上,经过分析比对,我们选择了长度分别为320 bp的EST片段。这个基因编码的蛋白质同其他真菌中的磷酸甘露糖异构酶有很高的同源性,通过cDNA文库筛选,获取其编码框;通过基因组步移法获得其DNA全长。利用RNAi的方法研究了磷酸甘露糖异构酶(Mapmi)的功能。主要研究结果如下:①获取了Mapmi基因的ORF和DNA全长,并进行了相关的生物信息学分析。Mapmi基因的ORF为1326bp,其Genbank登录号为HQ123439。预测该基因编码441个氨基酸。利用其ORF与绿僵菌基因组数据库比对分析,获得该基因的基因组DNA全长为1386bp。利用DNAMAN软件对DNA序列和ORF序列比对分析,结果表明,含有两个外显子和一个60bp的内含子,内含子位于距离起始密码145bp处,具有典型的GT….AG边界。通过网上软件预测该基因的分子量为47.65kDa,等电点为5.31,利用SignalP分析发现无信号肽。②采用RNAi的方法抑制其转录水平来初步确定Mapmi基因可能具有的功能。构建RNAi干扰载体pK2-RNAi-Mapmi,通过农杆菌介导的转化方法转化绿僵菌CQMa102,并用PCR方法验证提取的绿僵菌基因组,选取10个Mapmi基因的转化子,并通过定量PCR测定Mapmi基因在干扰突变株和野生菌株中的表达差异。测定结果分析,干扰突变株Mapmi基因表达被抑制后,干扰效率在42.5%-89.8%之间。③我们观察了Mapmi基因突变菌株在含有各类不同的细胞胁迫剂的PDA培养基上的生长及其形态。实验结果发现,干扰菌株在含有CR、KCl和H2O2的培养基上生长明显受到抑制;在加了KCl的培养基中的生长受抑制程度最大。在不加任何东西的固体PDA培养基上,干扰型生长速度和野生型相差不显著。野生型在各类培养基上生长正常。④分析了Mapmi基因干扰菌株在不同碳源培养基上的生长情况。干扰菌株和野生菌株的孢悬液分别接种于以葡萄糖或果糖为唯一碳源的培养基上培养,结果表明,与野生型相比,干扰株的生长明显受到抑制;将干扰菌株和野生菌株的孢悬液分别接种于不同浓度的甘露糖(0.003、3、30、300、420mM)为唯一碳源培养基上,结果表明,在体外补加的甘露糖浓度较低(0.003mM)和较高(420mM)的情况下,野生株和干扰株的生长都会受到影响,但是干扰株受的影响较大。而在3mM和30mM时,干扰型突变株生长回复。⑤测定Mapmi基因的干扰突变株在含有细胞胁迫剂的1/4SDA培养液中的菌丝干重即生物量。结果分析表明,在含有CR、KCl和H2O2的培养基上收集的生物量显著低于野生型,而在原始的1/4SDAY培养液里,干扰菌株与野生型相比,生物量差异不显著。⑥对Mapmi基因干扰菌株在PDA培养基及添加各种细胞胁迫剂情况的萌发率及产孢量的测定。干扰菌株和野生菌株的孢悬液分别接种于固体PDA培养上,定时测定其萌发率和产孢量。结果表明,干扰菌株在含有CR、KCl和H2O2的培养基上的萌发率和产孢量与野生型菌株的相比显著降低。⑦对Mapmi基因的干扰突变株进行了生物学毒力测定,采用体表侵染的生物测定方式点滴到蝗虫的前胸背板处,结果显示Mapmi基因被干扰后,菌株对蝗虫的致死时间延迟一天以上,干扰突变株的毒力显著降低。说明Mapmi基因影响菌株毒力。