目的:应用同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ),从差异蛋白角度分析肺炎支原体肺炎的致病机制(损伤/保护机制);进一步探索支原体肺炎与RORγt/Foxp3失衡及Notch通路的关系,分析清肺透邪方对肺炎支原体肺炎的调节作用及其疗效机制,为临床治疗提供新思路。材料与方法:1.应用iTRAQ技术分析支原体肺炎致病主要差异蛋白(支原体肺炎小鼠与正常小鼠对比)、相同感染下是否致病的主要差异蛋白(感染后非肺炎小鼠与感染后肺炎小鼠对比)。30只Balb/c小鼠按1:2的比例随机分为正常组和感染组,正常组10只,感染组20只。感染组予MP菌株滴鼻,正常组予0.9%生理盐水滴鼻,均100ul/只,滴3天,观察7天后处死小鼠取肺组织,根据病理学观察结果将感染组分为感染肺炎组和感染非肺炎组,将感染肺炎组、正常组、感染非肺炎组标本分别进行iTRAQ蛋白质组学检测,筛选差异表达蛋白,并对所筛选的差异蛋白进行生物信息学分析。2.将144只SPF级BABL/c小鼠随机分成6组,每组24只。各组分别为正常组、模型组、西药组、中药大剂量组、中药中剂量组及中药小剂量组。除正常组外,其余5组进行MP造模,再按照对应分组灌胃给药,于给药第3、7、10、14天进行取材。用Elisa法检测血清中IL10、IL17含量,镜下观察小鼠肺组织病理切片,用免疫组化法检测Foxp3、RORγt蛋白含量,用Western blot法检测Notch1、Notch2、Notch3蛋白的表达,采用qPCR法对Notch1mRNA、Notch2mRNA、Notch3mRNA、Foxp3 mRNA、RORγt mRNA含量进行测定。结果:1.感染肺炎组与正常组相比共鉴定出有定量信息的蛋白141个,其中上调蛋白85个,下调蛋白56个,前10个差异蛋白分别为:Sptan1、Myh6、Col1a1、Fasn、Col6a3、Iqgap1、Col1a2、Ttn、Limch1、Ncl,这些蛋白主要参与机体免疫、脂肪酸合成、碳水化合物代谢、核苷酸的结合、肌动蛋白结合、钙离子等金属离子的结合、肌动蛋白结合与调节、氧化代谢等。经过GO分析这些差异蛋白主要涉及的生物过程方面免疫系统处理、发育过程、解剖学结构、辅助因子代谢过程、多细胞生物发育、解剖结构形态发生、对有机物质的反应、系统发展、循环系统发展、动物器官发育等,其中最为显著的是GO:0048731系统发展。分子功能方面有结构分子活性、结合、细胞外基质结构、蛋白结合、酶结合、相同的蛋白质结合、蛋白质自结合、S100蛋白结合、血小板衍生生长因子结合等,其中最为显著的是GO:0005515蛋白结合。细胞组成方面:细胞外区部分、细胞外空间、细胞外组分、体元投射、质膜结合细胞投射、细胞质部分、(细胞内的)液泡、溶解液泡、溶菌体等,其中最为显著的是GO:0005737细胞质。通过散点图分析,得出富集的最大GO条目分别为L-谷氨酰胺、醛固酮、低密度酯蛋白、内胚层细胞、膜内骨化、过氧化氢生物合成、氧化应激的负调节、心肌纤维发育、糖原代谢分解、抗生素生物合成过程、细胞多糖分解代谢过程、多糖分解代谢过程。KEGG通路分析结果显示,富集显著性最高的途径是磷酸戊糖途径、溶酶体、背腹轴形成、蛋白质的消化吸收、氨基酸的生物合成、蛋白酶体、ECM-受体相互作用。通过蛋白与蛋白相互作用分析,发现Cdc42,Cyba,Cybb,Syk,Ptpn6,Rasgrp2,Hcls1,Arhgdib,Lcp1,Actr2,Myh6,l1gap1,Arpc2,Pfn1,Ttn,Ldb3,Actn2,Serpina3k,Myl7,Ppp1r12c,Cdc42bpg,Psmb8,Psmd11,Psma2,Psme1,Col5a1,Col5a2,Col1a2,Col1a1,Col6a2,Col6a,Col6a1处于关键位置,可能是对于支原体肺炎的发生有重要关系的蛋白。利用软件进行复杂网络模块化分析得出4个主要模块:模块1主要参与有机物质及细胞的代谢,模块2主要与对含氧化合物的反应及解剖结构形态发生相关,模块3主要与蛋白及离子结合、超分子聚合物、肌动蛋白细胞骨架、循环系统发育、氮化合物代谢相关,模块4主要与细胞通讯、信号传导相关。2.感染非肺炎组与肺炎组比较差异蛋白33个,其中上调蛋白5个,下调蛋白28个。前10个显著表达的差异蛋白均为下调蛋白,分别是Fasn,Cavin1,Anxa2,Hnrnpm,Cbr2,A1dh2,Tagln2,Inmt,Mthfd1,Actc1,Tufm,Inmt,Mthfd1,Actc1,Tufm,Pgd,Psmd11,Capn2,Arpc2,Ddost,Gstt1,Cct6a,Cox4il,Ivd。这些蛋白主要参与机体免疫、脂肪酸合成、肺的代谢、肌动蛋白结合、催化等。经过GO分析这些差异蛋白主要涉及的生物过程方面辅助因子代谢过程、氧化还原过程、有机物代谢过程等,其中最为显著的是GO:0051186辅助因子代谢过程。分子功能方面有催化活性、氧化还原酶活性、小分子结合、核苷酸结合、离子结合、阴离子结合、辅酶结合、磷酸核苷结合、细胞粘附分子结合、肌动蛋白结合、肌动蛋白丝结合、脂结合、离子结合、阴离子结合、含蛋白复合物结合等,其中最为显著的是GO:0016491氧化还原酶活性。细胞组成方面:细胞腹面、足小体环、肌动蛋白丝分支点、细胞质、胞质部分、细胞内部分、细胞内、线粒体、细胞器、膜结合细胞器、细胞内细胞器等,其中最为显著的是GO:0061835细胞腹面。KEGG通路分析结果显示,富集显著性最高的途径依次是背腹轴形成、Notch信号通路、色氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解、炎症性肠病、甘油脂代谢、谷胱甘肽代谢、内分泌抵抗、P450通过细胞色素P450的异生物的代谢、甲状腺激素信号通路、内质网中的蛋白质加工、代谢途径。通过蛋白与蛋白相互作用分析,发现Gm17087,Actc1,Arpc2,Tagln2,Anxa2,Serpina3g,Hsph1,Cct6a,Notch2,Notch3,Notch1,Pard3,Foxp3,RORγt,Serpinb6b,Clca3,Pard3,Ndufv3,Cox4i1,Ddost,Hnrnpm,Nxf1,Pgd,Fasn,Gpam,Fabp4处于关键位置,可能是对于感染支原体未引起肺炎中起重要作用的蛋白。利用软件进行复杂网络模块化分析,得出模块1主要参与免疫调节,模块2主要与肌动蛋白结合相关,模块3主要与脂肪酸的合成与转化、催化作用相关,模块4主要与线粒体相关酶,模块5主要与ATP水解相关,模块6主要与诱导信号事件,诱导炎性因子相关。3.MP感染后镜下可见气管管壁及周围间质充血,肺泡壁不完整,肺泡内有少量分泌物,肺泡间隔增厚,周围有炎细胞浸润,毛细血管扩张,符合炎症表现,西药组、中药大剂量组及中药中剂量组肺部炎症状较模型组轻,仅有轻度肺间质水肿,肺泡壁相对完整,仅有少量炎性细胞浸润。中药小剂量组与模型组差别不大,肺泡壁相对不完整,肺组织中度充血、水肿,细支气管及肺泡间隔中等量炎性细胞浸润。4.用Elisa法测定小鼠血清中IL-10、IL-17的含量,结果显示MP感染后小鼠血清中的IL-10含量明显减少(P<0.05),IL-17含量明显增高(P<0.05),IL-10含量正常组>中药大剂量组>中药中剂量组>模型组,西药组与中药大剂量组、中药中剂量组、中药小剂量组差异无统计学意义,大于模型组含量。中药中剂量组与中药小剂量组差异无统计学意义,大于模型组。中药小剂量组与模型组差异无统计学意义。各组不同时间IL-10的含量差异无统计学意义。IL-17的含量模型组>中药中剂量组>中药大剂量组>正常组,西药组与中药中剂量组差异无统计学意义,但小于中药小剂量组、模型组。中药小剂量组与模型组差异无统计学意义,但大于中药中剂量组、中药大剂量组、西药组。各组不同时间IL-17的含量差异有统计学意义,第3天、第14天含量小于第7天和第10天(P<0.05)。5.用免疫组化法检测小鼠肺组织中Foxp3及RORγt蛋白含量,结果显示MP感染造成Foxp3蛋白的下降(P<0.05)及RORγt蛋白的上升((P<0.05)),存在RORγt/Foxp3的失衡。中药组可下调RORγt蛋白,上调Foxp3蛋白,但与剂量基本成正比。西药组与中药中小剂量组相差不大。6.用Western blot法检测小鼠肺组织中Notch1,Notch2,Notch3蛋白的表达结果显示MP感染后,小鼠肺组织中Notch1、Notch2的蛋白表达明显增高(P<0.05),Notch3蛋白表达差异无统计学意义。Notch1蛋白表达在重复测量比较中,不同时间点之间差异有统计学意义(P<0.05),含量与病程长短成正比。中药大、中、小剂量组和西药组与模型组比较可下调Notch1、Notch2的表达,中药大剂量组疗效最佳。7.经qPCR检测小鼠肺组织中Notch1,Notch2,Notch3,Foxp3,RORγt mRNA的表达,结果显示MP感染后,小鼠肺组织中RORγt的基因表达明显增高(P<0.05),Foxp3基因表达明显降低(P<0.05)。RORγtmRNA含量不同时间差异无统计学意义,不同组别间有差异,模型组RORγt基因mRNA含量较正常组、西药组、中药大剂量组、中药中剂量组(P<0.05),模型组RORγt基因mRNA含量与中药低剂量组RORγt基因mRNA含量差异无统计学意义,余组间差异无统计学意义。Foxp3mRNA含量不同时间差异无统计学意义,不同组别间有差异。正常组Foxp3mRNA含量较其他各组均高,中药大剂量组Foxp3 mRNA含量高于模型组,余组间差异无统计学意义。MP感染后,小鼠肺组织中Notch1、Notch2的基因表达明显增高(P<0.05),Notch3基因表达差异无统计学意义。不同时间点之间差异无统计学意义。中药大、中、小剂量组、西药组与模型组相比可下调Notch1、Notch2基因的表达,中药大剂量组疗效最优。结论:1.iTRAQ蛋白组学研究技术可广泛应用于差异蛋白分析,揭示疾病机理及状态。2.肺炎支原体肺炎发病主要与机体免疫、脂肪酸合成、碳水化合物代谢、核苷酸的结合、肌动蛋白结合、氧化代谢等密切相关。3.相同感染下肺炎支原体肺炎是否发病与机体免疫、脂肪酸合成、肺的代谢、肌动蛋白结合、催化等密切相关。4.MP感染小鼠血清中IL10含量下降,IL17含量上升,存在IL-17/IL-10失衡。中药各剂量组能调节这种失衡,作用与剂量大致成正比,西药组作用与中药中、小剂量相近。第3天、第14天含量小于第7天和第10天。5.MP感染小鼠存在RORγt/Foxp3失衡,主要为Foxp3蛋白、Foxp3mRNA含量降低,RORγt蛋白、RORγtmRNA含量升高。清肺透邪方可有效治疗支原体肺炎,可能通过调节RORγt/Foxp3失衡相关,疗效与剂量成正比,与时间关系不大。6.MP感染后Notch1、Notch2明显升高,Notch3变化不大。清肺透邪方可以调节Notch1、Notch2的表达,主要为下调Notch1、Notch2表达,作用与剂量成正比,与时间关系不大。对Notch3影响不大。