目的:探索利用克隆化生长方式培养人角膜缘干细胞,并与不同部位角膜上皮细胞的增殖能力进行比较.应用细胞形态学、细胞免疫化学等方法研究培养的角膜缘干细胞增殖表型.材料与方法1)原代培养沿透明角膜以外2mm处切开眼球,环形剪下角膜瓣.去除角膜内皮层,分别用直径为6mm和10mm的角膜环钻,将角膜组织分成中央,周边和角膜缘三部分.将每部分组织剪成1×lmm<2>大小,上皮面朝下,在5﹪CO<,2>,37℃环境中培养,此后每天在倒置相差显微镜下观察,隔日更换培养液.2)有限稀释克隆化培养法先在96孔板中每孔加3滴培养液,在每行的第1孔滴加上述原代细胞悬液一滴,轻轻吹打3次后,从中吸取一滴加入到该行第2孔,再次吹打后取一滴加入到第3孔,如此依次稀释至最后一孔.然后将96孔板放入CO<,2>培养箱中培养,次日镜下观察各孔细胞数,挑选细胞数在5个以内的孔作标记,培养液加至标准量(0.1ml),继续培养.选生长良好的细胞克隆孔,用混合消化液消化5~10min,制成细胞悬液,移到新培养皿中培养.3)倒置相差显微镜下观察观察细胞生长状况、克隆形态.4)电子透射电子显微镜下观察角膜缘组织和细胞的超微结构.5)细胞免疫组织化学第一抗体包括l:100稀释的单克隆鼠抗人细胞角蛋白Ckl9和PCNA.第二抗体是生物素化辣根过氧化物酶羊抗鼠IgG抗体.以二氨基联苯胺(DAB)作为染色剂.结论:我们通过克隆化培养获得快速增殖、克隆生长的角膜缘干细胞,而角膜中央和周边上皮不能维持生长而被淘汰.通过细胞形态、生长特性、细胞免疫化学实验等多方面细胞表型观察,提示角膜缘干细胞在体外能保持原始特性.本研究不仅提供了一种适合干细胞生长的培养方式,而且为研究角膜缘干细胞的生物学特性、体外分化诱导和临床应用提供理论依据和实验基础.