以往的研究认为,临界型鸣禽在鸣唱习得成功之后,鸣曲保持终生不变。近来行为研究显示,成年鸣禽在不同行为状态下的鸣曲也具有显著变化,是使鸣唱最优化的持续运动学习过程。弓状皮质栎核(RA,robust nucleus of the arcopallium)是鸣唱系统中重要的前运动核团之一,是影响鸣唱的最直接作用位点。在体电生理学和药理学的研究证实,鸣禽的鸣唱可变性与1MAN-RA突触N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体活动直接有关,但其具体机制尚不清楚。在哺乳动物中的研究表明,增益(gain,指神经元对输入信号的反应调节)在正常感觉、认知和运动功能中具有至关重要的作用。　　 本研究使用膜片钳全细胞记录技术,在成年斑胸草雀离体脑片中探索比较RA核团内不同类型神经元的电生理特性,并运用外源性激动剂NMDA选择性激活NMDA受体后,观察RA核团投射神经元增益的变化,并进一步探讨其增益调节的可能机制。全文包含三个部分。　　 第一部分成年斑胸草雀RA核团的全细胞记录　　 该部分探讨了在RA核团进行膜片钳全细胞记录的可行性,并对其关键步骤和需要注意的问题进行重点说明。结果显示大部分细胞能形成高阻抗封接(＞1GΩ)。应用全细胞模式观察记录RA神经元膜的主动和被动特性,并成功记录钠、钾电流以及自发突触活动。结果表明,在本实验条件下RA神经元保持相对良好的生理活性,适用于全细胞记录。　　 第二部分成年斑胸草雀RA核团神经元电生理特性的研究　　 该部分通过全细胞记录技术探索了RA核团中的神经元类型,比较详细地比较了RA核团中的不同类型神经元被动特性和发放特性,结果显示在RA中存在两类完全不同的神经元:Ⅰ型神经元和Ⅱ型神经元。　　 Ⅰ型神经元(96/108)具较大的输入阻抗和时间常数;给予超极化电流时,可诱导Ⅰ型神经元独特的时间依赖性的内向整流,使用非选择性超极化电流激活阳离子通道阻断剂CsCl能阻断该内向整流。在自发状态下,Ⅰ型神经元表现出规律的动作电位发放,其动作电位后超极化潜伏期相对较长。而Ⅱ型神经元(12/108)的输入阻抗和时间常数较小,无内向整流现象;且在静息状态下,无动作电位发放,阈强度引起其动作电位发放后,其动作电位的后超极化潜伏期与Ⅰ型神经元的相比明显较短。　　 在发放特性上,Ⅰ型神经元对持续的去极化电流表现出规律性发放,具有较小的反应频率—注入电流(firing frequency-injected cuttent)曲线斜率;而Ⅱ型神经元对持续去极化电流表现出极不规律的发放,且具有较大的反应频率—注入电流曲线斜率,两者差异显著。该特性与在斑胸草雀发育时期RA核团中通过细胞内记录的投射神经元和中间神经元的发放特性一致。根据以上特性鉴定Ⅰ型神经元为投射神经元,Ⅱ型神经元为中间神经元。　　 第三部分 NMDA对RA投射神经元增益的调节　　 该部分选择性激活NMDA受体后,记录RA投射神经元的全细胞电流,观察其对RA投射神经元兴奋性以及对输入信号反应(增益)的影响,并进一步探讨了其增益调节的可能机制。　　 1)首先观察NMDA对RA投射神经元兴奋性的影响。给予NMDA之后,RA投射神经元膜电位先表现出1min左右的短暂超极化,随即表现为去极化反应,该超极化和去极化过程均表现出浓度依赖性。50μMDL-APV同时阻断超极化和去极化过程,而10μM GABAA受体阻断剂bicuculline仅能阻断超极化过程,以上结果暗示NMDA诱导的超极化可能与GABA能中间神经元的活动有关。在中间神经元进行记录的结果发现,给予NMDA后,能记录到去极化电流。以上结果表明,NMDA可能通过激活中间神经元双向调节RA投射神经元兴奋性。　　 2)注入不同强度的去极化电流引发RA投射神经元不同频率的动作电位发放,检测NMDA对RA投射神经元反应频率-注入电流(firingfrequency-injected current,F-I)曲线斜率(增益)的影响。结果发现NMDA20μM能提高RA投射神经元在小于60Hz的发放频段的反应敏感性。使用系列脉冲(0-90pA,阶跃10pA,间隔30s)诱导出RA神经元在5～50Hz频段发放,对其F-I曲线进行线性拟合后,斜率为235.94±30.51Hz/nA,给予20μM NMDA后其斜率提高至338.55±71.11Hz/nA(n=12,P＜0.05),差异显著;该效应能被50μM DL-APV完全阻断。但单独应用50μM DL-Apv前后RA投射神经元的斜率为255.78±66.69Hz/nA和269.34±56.96Hz/nA(n=14,P＞0.1),无显著性差异。以上结果表明,20μM NMDA能提高RA投射神经元的增益。　　 3)从突触前和突触后两方面检测NMDA对RA投射神经元增益调节的可能机制。首先应用CNQX和bicuculline分别阻断AMPA受体和GABAA受体以检测突触前兴奋性和抑制性作用在NMDA介导的增益调节中的作用。结果发现:(1)10μM bieuculline对膜电位和F-I曲线斜率几乎无影响;而同时应用bieuculline和NMDA后,F-I斜率由321.46±59.4Hz/nA提高至352.6±40.02Hz/nA(n=6,P＞0.05),无显著差异。(2)应用8μM CNQX后,RA投射神经元兴奋性显著降低,几乎不能表现出自发放,但其F-I曲线斜率未发生明显改变;且当存在CNQX时,无论是否使用bicuculline,NMDA均未能改变RA投射神经元F-I曲线斜率(n=8,P＜0.01)。以上结果暗示,AMPA受体介导突触前兴奋作用,可能通过“开关”或者门控作用,在NMDA受体介导的RA投射神经元的增益调节中起关键作用。　　 突触后NMDA的受体激活引起突触后细胞去极化并导致胞内钙离子浓度升高,在此我们检测了膜电位去极化与胞内钙离子在NMDA介导的增益调节中的作用。结果如下:　　 (1)单独给予去极化电流提高膜电位后使F-I曲线右移,但并未明显改变F-I曲线斜率。而给予NMDA的同时钳制-20pA的超极化电流逆转膜电位去极化后,NMDA对F-I斜率效应在半数细胞中被抑制,暗示除膜电位之外可能还存在其它因素参与NMDA诱导的增益调节。　　 (2)使用含20mM EGTA电极内液螯合胞内钙离子变化,发现高浓度的EGTA存在时,NMDA只能使RA投射神经元F-I曲线斜率提高至原来的112.08±8.17％(n=8,P＞0.1),无显著差异。以上结果表明,钙离子在NMDA介导的增益调节中可能有重要作用。　　 (3)我们发现胞内20mM EGTA或者单独在胞外给予200μMCdCl2均能使RA投射神经元F-I曲线斜率提高200％以上(n=6,P＜0.001),且伴随动作电位后超极化幅度显著减小。但NMDA并未引起RA投射神经元动作电位特性的明显变化,以上结果暗示钙离子可能通过其它机制,而不是通过改变动作电位特性参与NMDA介导的增益调节。　　 (4)进一步检测RA投射神经元的输入阻抗变化,发现NMDA使细胞阻抗由243.71±3.28降低至217.01±6.08(n=8,P=0.022),钙离子通道阻断剂CdCl2能完全阻断NMDA引起的输入阻抗降低,以上结果暗示NMDA介导的增益调节可能涉及钙离子依赖性离子通道的活动。　　 综上结果,突触前与突触后机制共同参与NMDA对RA投射神经元增益的调节;其中AMPA受体介导的突触前兴奋性活动具有关键作用,而突触后胞内钙离子可能通过调节钙依赖性离子通道的活动在此发挥重要作用。