苦荞蛋白的分离提取及其对ApoE-/-动脉粥样硬化小鼠的影响

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目的:本课题旨在分离提取苦荞蛋白的基础上,评价苦荞蛋白各组分的体外抗氧化能力;并将苦荞蛋白作用于建立成功的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化(AS)模型,通过观察苦荞蛋白对 ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化疾病的影响,初步探讨苦荞蛋白与动脉粥样硬化(AS)的相关性。  方法:1.采用碱溶酸沉法分离苦荞总蛋白,并根据蛋白溶解性不同分离出苦荞清蛋白和球蛋白;采用考马斯亮蓝蛋白定量法测定各组分的蛋白含量,SDS-PAGE凝胶电泳观察各蛋白组分的分子量分布情况;通过测定各蛋白组分的抑制羟自由基产生能力和抗超氧阴离子能力来评价各蛋白组分的体外抗氧化活性;2.以8周龄健康雄性ApoE-/-小鼠作为研究对象,采用高脂饲料喂养以加速ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的模型建立,并定期收集各组小鼠的血清,采用酶法检测血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;主动脉血管采用油红O染色;3.72只ApoE-/-雄性小鼠随机分为8组,即正常饮食对照组、高脂饮食模型组、总蛋白预防组、清蛋白预防组、球蛋白预防组、总蛋白治疗组、清蛋白治疗组及球蛋白治疗组,每组9只。正常饮食对照组给予普通饲料喂养,高脂饮食模型组给予高脂饲料喂养,各蛋白预防组在给予高脂饮食的同时给予各蛋白(25mg/kg/d)灌胃10周,各蛋白治疗组在高脂喂养10周后再给予各蛋白(25mg/kg/d)灌胃,连续给药10周后处死小鼠,收集小鼠血清样本,并进行各项血脂水平及血清氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)水平检测,以观察相关指标的变化状况。  结果:1.每克脱脂苦荞粉中苦荞总蛋白、清蛋白和球蛋白的含量分别为82.05、13.24和4.37mg;各蛋白的分子量分布不同;体外抗氧化测定中总蛋白、清蛋白和球蛋白均具有抑制羟自由基产生能力和抗超氧阴离子能力,且球蛋白的体外抗氧化能力高于总蛋白和清蛋白(p<0.05);2.经高脂饲料诱导的ApoE-/-小鼠的血清TG和TC水平均比未经诱导的ApoE-/-小鼠显著升高(p<0.05);高脂诱导 ApoE-/-小鼠的主动脉斑块面积占整体主动脉面积的65%,显著高于ApoE-/-小鼠的正常饮食组(21%)(p<0.05),同时主动脉根部的血管壁明显增厚,管腔变窄;3.和高脂喂养的模型组相比,经总蛋白、清蛋白、球蛋白进行预防及治疗的各组AS小鼠的血脂TG、TC、LDL-C水平均明显降低(p<0.05);各预防及治疗组小鼠的血清ox-LDL、TNF-α、IL-6、sICAM-1水平也比高脂模型组明显下降(p<0.05)。  结论:1.苦荞中的总蛋白、清蛋白及球蛋白均具有体外抗氧化活性;2.经高脂饲料饮食诱导,成功建立了动脉粥样硬化模型小鼠;3.苦荞蛋白具有降低AS小鼠血脂及机体炎症反应水平的作用,苦荞蛋白可能对AS有一定的预防和治疗作用。
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