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目的:通过体内动物实验研究二丁二仙汤及其君药淫羊藿苷防治肾间质纤维化的作用及机制。方法:10周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为7组,假手术组(SHAM)、模型组(UUO)、模型+二丁二仙汤组(EDEX+UUO)、模型+雌二醇组(E2+UUO)、模型+淫羊藿苷组(ICA+UUO)、模型+GPR30拮抗剂组(G-15+UUO)、模型+GPR30拮抗剂+淫羊藿苷组(G-15+ICA+UUO)。单侧输尿管梗阻模型的制作,小鼠逐层打开腹腔后,游离左侧输尿管,本模型采用4-0丝线结扎,结扎左肾下级水平,关闭腹腔并逐层缝合。本模型通过手术结扎一侧输尿管引使肾脏引流系统梗阻,从而引起慢性肾损伤,进而导致肾间质纤维化。G-15给药方式均予以皮下植入微渗透压泵(Alzet Minipump model 1007D),给药速率为200μg/kg/d,维持7天。治疗7天后,各组小鼠进行心脏灌注,予以眼球采血,提取血清,检测雌二醇水平、两侧肾脏摘除,称取重量,固定后进行Masson’s、HE、PAS染色,光镜下观察肾脏病理情况。荧光定量PCR检测c-Myc,FN,Ⅰ型胶原,GPR30 m RNA表达变化。Western Blot方法检测总β-catenin、磷酸化β-catenin(ser-552)、GPR30、c-Myc蛋白表达变化。免疫荧光检测a-SMA、Ⅰ型胶原,免疫组化检测GPR30。结果:(1)实验前后小鼠体重无明显差异(P>0.05)。ICA+UUO组与G-15+UUO组比较,血清雌二醇水平提高(P<0.05),G-15+ICA+UUO组与G-15+UUO组比较,血清雌二醇水平增高(P<0.05)。(2)肾脏组织病理染色,Masson’s染色显示,与假手术组比较,模型组的间质纤维程度明显,间质蓝色胶原面积显著增多,光镜视野下大量肾小管萎缩、扩张,同时间质伴有大量单核细胞的浸润,肾小球存在部分性代偿增大,二丁二仙汤组和淫羊藿苷组与模型组相比,肾间质纤维化的程度有不同程度的改善,大体表现为皮髓质界限较模型组清晰,另外有部分小管的上皮细胞仍维持相对完整的结构,肾小管扩张程度较模型组轻,间质内蓝色胶原面积以及单核细胞浸润情况较模型组好转。PAS染色提示,模型组小鼠有蛋白管型形成,肾小管扩张,刷状缘的脱落,间质纤维化,肾小球硬化,EREX+UUO及ICA+UUO组肾脏病理明显改善。肾脏病理损伤评分也显示UUO组肾小管及间质损伤,小动脉硬化,肾小球硬化程度较EREX+UUO及ICA+UUO组纤维化程度高。HE染色显示模型组大量炎性细胞浸润,EREX+UUO及ICA+UUO组程度相对较轻。(3)免疫荧光显示:在假手术组α-SMA只在血管上表达,而在UUO组及G-15+UUO及G-15+ICA+UUO组,间质表达增多。a-SMA及I型胶原肾组织免疫荧光也显示G-15干预UUO后,纤维化加重,二丁二仙汤组和淫羊藿苷组肾纤维化程度较之UUO较轻。(4)肾脏组织GPR30免疫组化染色,可见棕黄色染色,发现与SHAM组相比,UUO组GPR30表达量明显下降。(5)实时定量PCR和Western Blot结果提示UUO组小鼠纤维化指标FN、c-Myc、总β-catenin、磷酸化β-catenin(ser-552)表达比SHAM组明显增加。GPR30阻断剂组小鼠FN、Ⅰ型胶原、c-Myc、总β-catenin、磷酸化β-catenin(ser-552)表达升高。ICA+UUO、EDEX+UUO组与UUO组比较,小鼠纤维化表达表达降低。同时EDEX+UUO组与ICA+UUO组与UUO组比较,小鼠GPR30水平表达增高。(6)对GPR30进行免疫组化染色我们发现,在假手术组中,GPR30主要大量表达在肾小管上皮细胞,而在肾脏梗阻的情况下,肾小管受打击后,肾小管上皮细胞GPR30表达明显下降,而使用G-15(GPR30拮抗剂)可使UUO纤维化程度加重。同时予α-SMA和I型胶原肾组织免疫荧光染色也提示,G15干预UUO后,纤维化加重,EDEX+UUO组与ICA+UUO组可改善肾纤维化,而q PCR结果亦提示在G15可明显加重FN m RNA表达。结论:1、二丁二仙汤和淫羊藿苷能提高UUO肾纤维化模型小鼠雌二醇水平,减少肾组织FN,Ⅰ型胶原,a-SMA、cmyc等纤维化成分的聚积,降低肾脏病理损伤的程度,从而保护肾脏功能,提高GPR30的表达,调控Wnt/β-catenin信号通路,延缓肾纤维化的进程。2、GPR30拮抗剂可协同加重纤维化进展,提示GPR30可能对肾脏纤维化有重要保护作用,阻断其表达后,可引起纤维化加重。与此同时淫羊藿苷对肾纤维化有一定保护作用,可能从GPR30起作用,干预肾脏纤维化。3、EREX+UUO及ICA+UUO组干预,小鼠蛋白免疫印迹有明显趋势,但无统计学意义,提示药物作用时间的可能较短,有待进一步的研究。