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研究目的及意义原始卵泡是雌性哺乳动物卵巢储藏库的基本单位,一旦形成便不可再生更新,虽然最初形成的原始卵泡有数百万之多,但随着个体的发育,99%以上的卵泡最终都闭锁退化,只有极少部分的卵泡最终能发育成熟,造成了对雌性生殖资源的巨大浪费。因此,原始卵泡的储备数量及闭锁程度都将直接影响雌性哺乳动物的生殖能力。一旦原始卵泡闭锁或消耗过快,便会引发卵巢早衰(premature ovarian failure, POF),导致内分泌失调和不孕症等。所以,研究原始卵泡的生长发育及其调节机制对更深入地了解雌性哺乳动物的生殖机理具有重要的理论和实际意义。原始卵泡是一种处于休眠状态的卵泡,它一旦被启动便是一个不可逆的连续的分化和发育过程,要么变成优势卵泡,使卵子成熟与排放；要么中途闭锁退化。原始卵泡的发育启动是指原始卵泡由休眠状态变成生长状态的过程,即原始卵泡转变为初级卵泡。这一过程是卵泡早期发育过程中最关键的环节,其机制一直是生殖生物学研究的热点。近年来的研究发现,原始卵泡发育的启动阶段不依赖于下丘脑-垂体,而受卵巢内自分泌／或旁分泌因子的调控。骨形态发生蛋白4(bone morphologenetic protein4, Bmp4)是一种分泌性多功能糖蛋白,属于转化生长因子β(transforminggrowth factor-β,TGF-β)超家族的成员之一。已证实,卵巢组织来源的Bmp4参与了原始卵泡发育的启动过程,能调控卵巢的生理学功能和雌性哺乳动物的生殖能力,尤其在原始卵泡生长发育中发挥重要的调节作用。但其具体作用机制尚不清楚。因此,本课题探讨了Bmps家族经典的信号传递途径Bmp4/Smad信号通路,在小鼠原始卵泡存活和启动发育中的作用及作用机制。本实验取3日龄昆明小鼠卵巢体外培养,检钡Bmp4在原始卵泡存活和启动发育中的作用,并探讨其可能的作用机制；然后体内实验观察Bmp4. p-Smad1/5/8、 Sohlh2及c-Kit随着小鼠卵巢的发育在原始卵泡中的表达及变化规律,进一步验证Bmp4-Smad-Sohlh2-c-Kit信号通路的作用机制。实验结果不仅有助于揭示原始卵泡存活和发育的分子调控机制,而且为充分利用卵巢中庞大的卵泡资源,治疗临床不孕症和卵巢早衰提供理论和实验依据。研究方法1.检测Bmp4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡发育中的作用及作用机制取3日龄雌性昆明小鼠卵巢体外培养,将培养的卵巢随机分为正常对照组(Con组)和添加重组Bmp4组(Bmp4组)。在解剖镜下对比培养8天后两组卵巢的大小；采用HE染色法,比较两组卵巢的大小及两组卵巢切片最大截面上原始卵泡、初级卵泡的数量；通过TUNEL法对比两组原始卵泡中卵母细胞凋亡所占比例的差异；通过免疫组织化学、Western blotting及RT-PCR法检测p-Smad1/5/8、Sohlh2及c-Kit于各组中的表达及变化规律。2.观察Bmp4、p-Smad1/5/8、Sohlh2及c-Kit随着小鼠卵巢的发育在原始卵泡中的表达及变化规律分别取0w(新生)、1w、3w、6w和8w雌性昆明小鼠卵巢,石蜡包埋,连续5μm切片,采用免疫组织化学方法检测Bmp4、p-Smad1/5/8、Sohlh2及c-Kit蛋白在小鼠原始卵泡中的表达及变化情况。结果1.①培养8d后,解剖镜下观察Bmp4组的卵巢直径明显大于Con组；HE染色结果显示,两组卵巢切片最大截面上Bmp4组原始卵泡数量明显低于Con组,而初级卵泡的数量明显高于Con组,差异有显著意义(P<0.05)；②培养48h后,TUNEL结果显示Bmp4组凋亡卵母细胞所占比例明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。③免疫组织化学结果显示,卵巢分组培养24h和48h后,Bmp4组原始卵泡卵母细胞核内p-Smadl/5/8的阳性表达明显高于Con组,差异有极显著意义(P<0.01)；Sohlh2主要分布于卵母细胞的细胞质和胞核内,阳性表达水平Bmp4组明显高于Con组,差异有极显著意义(P<0.01)；c-Kit主要存在于卵母细胞的胞质和细胞膜,其中细胞膜的阳性着色更明显,Bmp4组c-Kit阳性表达水平也高于对照组,差异有显著意义(P<0.05)。Western blotting结果与免疫组化结果一致,Bmp4组的p-Smad1/5/8蛋白表达水平明显高于对照组,差异有极显著意义(P<0.01)；Sohlh2及c-Kit蛋白的表达水平Bmp4组也高于对照组,差异有显著意义(P<0.05)。RT-PCR结果显示,培养8h后Bmp4组的sohlh2及c-kit mRNA水平即明显增加高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)；培养24h的结果与8h结果一致。2.免疫组织化学结果显示,Bmp4、p-Smad1/5/8、Sohlh2及c-Kit蛋白在各周小鼠卵巢中均有表达。Bmp4、p-Smad1/5/8主要分布于原始卵泡卵母细胞的胞质和胞核,以及前颗粒细胞内,细胞核内的阳性表达水平较高；Sohlh2主要分布于各周小鼠原始卵泡卵母细胞的细胞质和胞核内；c-Kit主要存在于各周小鼠原始卵泡卵母细胞的细胞质和细胞膜上,细胞膜的阳性着色更明显。经对比各种蛋白的表达变化规律相似,其中0w至3w表达水平较高,3w以后随着发育成熟,表达逐渐减弱。结论1.激活Bmp4/Smad信号通路可促进小鼠原始卵泡向初级卵泡转变,并抑制卵母细胞的凋亡；2、Bmp4/Smad信号通路可能通过上调sohlh2及c-kit基因的表达而发挥作用。3.Bmp4. p-Smad1/5/8、Sohlh2及c-Kit蛋白在各周小鼠原始卵泡中均有表达,并参与原始卵泡的发育启动。